食品微生物检验技术研究进展

刘生峰， 杨 俊， 陆丽华

(重庆出入境检验检疫局，重庆 400020)

食品微生物检验是食品卫生安全评价的重要技术手段之一。近年来，随着我国国民经济的迅猛发展以及社会主义精神文明建设的不断提高，食品安全愈来愈受到社会的广泛关注，食品微生物检验在服务社会公众及政府职能部门对食品安全进行评价及质量监管方面发挥着重要作用。然而，食品微生物检验技术的现状并不令人满意，检验操作繁琐、检验周期长、检验工作效率低等问题一直是困扰食品微生物检验工作的技术瓶颈,与当前社会的发展需求有着较大的差距。因此，如何发展快速、高效、准确的微生物检验新技术和方法，满足社会经济发展需求，是食品微生物检验工作的当务之急[1-2]。

1 食品微生物检验技术现状

长期以来，食品微生物检验一直遵循增菌培养、分离纯化、形态学及生化、血清学鉴定这样的传统方法。传统方法具有准确可靠的特点，但却存在检验周期长、检验操作繁琐、效率不高的问题。如增菌培养、分离纯化、生化鉴定等步骤通常都分别需要1 d以上的培养时间；平板分离的挑菌落步骤，需要有一定工作经验的检验人员才能胜任；鉴定一个对象菌需要做多个生化试验才能完成等[3]。2003年以前我国发布的食品微生物检验国家标准(GB 4789标准系列)几乎都是采用上述传统检验方法。直到2008年以后发布的国家标准中才开始逐渐引入了一些新的检测技术和方法。如：GB4789.4-2010食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验；GB/T 4789.36-2008 食品卫生微生物学检验 大肠埃希氏菌O157∶H7/NM检验等国家标准中就引入仪器自动化生化鉴定方法、免疫磁珠捕获法、全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法、全自动病原菌检测系统筛选法等新技术方法。国家质检总局近年来发布的出入境检验检疫行业标准中，也有引入PCR检测方法、环介导恒温扩增(LAMP)检测方法、基因芯片法等一些新的检验技术方法。如SN/T2525-2010食品中肉毒梭菌的PCR检测方法；SN/T2754-2011出口食品中致病菌环介导恒温扩增(LAMP)检测方法系列标准；SN/T2651-2010肉及肉制品中常见致病菌检测方法 基因芯片法等。

2 微生物检验技术的新进展

近年来，随着分子生物学技术、仪器自动化分析技术等各种生物分析技术的快速发展，食品微生物检验技术也有了新突破，出现了许多新的检测技术和方法。

2.1 基于传统微生物检测技术上的改进

对一些培养基成分进行改良，提高培养基的特异性增菌或分离效果，如：沙门氏菌、志贺氏菌显色培养基；对培养基的使用便利性进行改进，如快速检测纸片、集成化的生化鉴定试剂条及仪器自动化技术。将传统检验中比较繁琐的实验操作通过仪器自动化完成，如：生物梅里埃的VITEK全自动微生物鉴定系统[4-5]，即是通过仪器自动化完成微生物的生化鉴定及结果分析工作。

2.2 免疫学快速筛选方法

由于免疫学反应的快速、灵敏、特异性等特点，可以将其用于目标微生物的快速筛选[6]。如：大肠埃希菌O157∶H7的乳胶凝集试验、沙门氏菌的胶体金快速检测试剂条等。这类方法可以对目标微生物进行简单的快速筛选。免疫磁珠捕获法则是通过免疫磁珠对目标微生物的富集，提高传统方法的敏感性[7]。全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法则是将微生物的免疫学筛选由仪器自动化完成。

2.3 基于核酸扩增的分子诊测技术

近年来，随着分子生物学技术的快速发展，基于核酸扩增的各种微生物检测新技术和新方法不断涌现。出现最多的是PCR方法和荧光定量PCR方法[8-9]。此外还有基于等温扩增技术的环介导恒温扩增(LAMP)方法[10]、NASBA方法[11]等。这类方法首先都需要对目标微生物的核酸保守序列进行分析，设计特异性引物，建立核酸扩增体系。通过扩增体系中引物对目标微生物特征核酸片段的快速扩增，使目标微生物的特征核酸片段数量迅速放大，进而能够检测到扩增的目标核酸片段。其优点是能在短时间内将目标微生物的特征核酸片段数量扩增放大，从而达到快速筛选目标微生物的目的。

此后，在PCR技术基础上又发展了多重PCR技术。即：针对多个目标微生物的核酸序列设计多对引物，对多个目标微生物的核酸片段同时进行扩增，扩增结果可通过琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳、基因芯片杂交等技术进行结果分析，进而发展出一些多项目并行检测的高通量检测方法。如Shin等[12]基于细菌的16S rRNA设计寡核苷酸探针建立了可同步建成食品中16种致病菌的基因芯片检测方法；肖进文等[13]针对肉及肉制品中沙门氏菌等5种致病菌建立的基因芯片方法等。多重PCR技术具有节约成本、检测效率高的特点，一次能扩增多个目的基因片段。但该技术随着引物对数的增多，扩增体系的条件摸索较复杂，容易出现多重PCR扩增过程中各对引物扩增效率不均以及非特异性扩增等问题。于是有人开始研究对多重PCR技术的改进方法,Zhou等[14]针对食品中6种致病菌建立的GeXP(GenomeLab Gene Expression Profiler)多重基因分析方法(图1)是一种新型的多重PCR结合毛细管电泳分析的高通量分析方法。该法在设计引物时，设计一对通用引物，并在特异性引物一端加上一段能被通用引物识别的标签序列。多重PCR过程分两个阶段完成：初始阶段由特异性引物对目标基因进行特异性扩增，第二阶段则是由通用引物对初始扩增产物进行二次扩增。初期扩增是在低浓度下的特异性扩增，各引物间的扩增效率不易受到影响。第二阶段扩增由一对通用引物引导，与一对引物的PCR扩增体类似。扩增产物经毛细管电泳系统分析。该法较好地解决了多重PCR扩增过程中各对引物扩增效率不均的难题。对6种目标菌的靶序列同时进行多重PCR扩增，能达到满意的扩增结果。Villamizar-RG等[15]则是把多重PCR和毛细管电泳技术结合，建立一种经过通用方法前增菌富集后可同步检测9种致病菌的高效灵敏检测方法。

此外，钱雪峰等[16]利用Tem-PCR结合Luminex技术建立了对葡萄球菌及其耐药基因进行快速检测的高通量检测方法。Tem-PCR技术跟GeXP技术类似，设计待扩增的每一种靶序列的特异性引物，增加一对超级引物，特异性引物中带有能被超级引物识别的标签序列。扩增过程分三个阶段：富集阶段、加标阶段和扩增阶段。富集和加标阶段是低浓度下，特异性异物对靶标序列的特异性扩增；扩增阶段是高浓度的超级引物对特异性扩增产物的大批量扩增。该法能同时对葡萄球菌的18种分子标靶序列进行扩增。Tem-PCR扩增结果通过Luminex液相芯片技术进行检测。

2.4 其他新兴的微生物检测技术和方法

脉冲场电泳技术鉴定微生物，则是另一种基于核酸分子的微生物分型鉴定技术。如：范放等[17]利用脉冲场电泳技术对进出口食品中的肠炎沙门氏菌进行分子分型分析，建立了肠炎沙门氏菌的DNA指纹图谱数据库。该法通过限制性内切酶对核酸分子进行切割，用脉冲场电泳系统对酶切后的核酸片段进行分离，得到不同大小核酸片段的脉冲场电泳条带。在相同条件下，同种微生物核酸分子形成的脉冲场电泳条带是相同的，不同微生物核酸分子形成的脉冲场电泳条带不同。据此，可用已知微生物建立DNA指纹图谱数据库，将待检菌核酸分子的脉冲场电泳条带与数据库中已知菌的脉冲场电泳条带比对，从而达到鉴定微生物的目的。

图2 MALDI-TOF MS技术原理Fig.2 Principle of MALDI-TOF MS

此外，由生物梅里埃公司等推出的MALDI-TOF MS(图2)微生物基质辅助激光解析飞行时间质谱分析方法(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry)，是微生物分析的又一种全新技术。该法以飞行时间质谱技术为核心，微生物细胞在特定条件下裂解、离子化，形成若干分子量大小不同的离子碎片，离子碎片在真空飞行管中自由飞行，分子量越小，飞行速度越快，越先到达飞行管末端，而位于飞行管末端的检测器就能依次检测到不同质量碎片到达的信号，从而得到细胞裂解碎片的质谱图。同一种微生物细胞在相同裂解条件下，得到的飞行质谱图是相同的；不同微生物细胞裂解所得到的飞行质谱图不相同。据此，可以首先用已知的标准菌株细胞经时间飞行质谱进行分析，得到该菌株的特征质谱图，建立标准质谱数据库。将待检菌株通过飞行质谱进行检测，得到待检菌株的质谱图，待检菌株的质谱图与数据库中的标准质谱图进行比对，得出鉴定结果[18]。该法能够在数十分钟内对细菌、真菌等进行快速鉴定，是目前最高效的微生物仪器鉴定方法之一。

微生物学与其他学科相结合，如生物传感器技术[19]、电化学发光、生物发光技术等的结合也诞生出一些新型的检测方法。如Sharp等[20]报道了利用噬菌体介导生物发光技术检测食品中炭疽杆菌的快速检测方法。

图3 流式细胞计数原理Fig.3 Principle of Flow Cytometry

在微生物的计数检测方面也有一些新技术出现。如碧迪公司的BD FACS MicroCount全自动微生物计数分析仪直接计数法(图3)。该法将流式细胞计数技术和荧光染色技术结合，对样本中的活菌、死菌直接进行计数。数分钟内就能得到直接计数结果。与传统的平板计数方法至少需要1 d以上培养时间相比，其效率有了质的飞跃。

3 展 望

随着分子生物学检测技术和仪器分析技术的飞速发展，为食品微生物检测技术的发展带来了新的契机。以传统微生物检测技术为基础的仪器自动化技术日趋成熟，将愈来愈多地应用到日常检验工作中。基于核酸扩增的PCR方法、荧光定量PCR方法以及环介导恒温扩增(LAMP)方法等技术，因其快速、灵敏的特点，将会在食品微生物检验工作中得到进一步的发展。基因芯片技术、GeXP技术、Tem-PCR技术、Luminex液相芯片技术等多项目并行检测技术，是大批量样本检测工作中更加快速、高效的高通量检测方法，值得进一步探索和发展。DNA指纹分析技术是在分子水平上对微生物进行分型鉴定的一种新尝试。MALDI-TOF MS飞行时间质谱分析技术，能够大幅度提升微生物鉴定的工作效率，是一种全新高效的微生物快速鉴定技术。基于流式细胞计数技术和荧光染色技术结合的微生物直接计数技术，是真正意义上的微生物直接计数，能够将传统的微生物计数检测时间由数天缩短到数十分钟，是微生物计数检测技术的革命性发展。

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