马尾藻多糖对PCV—2体外感染3D4/2细胞活性及炎症相关因子的影响

谭红连+杨剑+尹丹+郝祝兵+韦英益+胡庭俊

摘要：首先通过MTT法检测马尾藻多糖对3D4/2细胞活性的影响，然后用ELISA法检测炎症相关因子。试验结果，PCV-2感染3D4/2细胞后明显降低细胞活性，马尾藻多糖25、50、100、200、400 μg/mL处理后，均能提高感染细胞的活性；PCV-2感染3D4/2细胞后均能显著提高TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等炎症因子的水平，马尾藻多糖处理后，25、50、100、200、400 μg/mL均能在一定程度上降低TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、MCP-1的分泌水平，且其中25、50 μg/mL的效果最明显。结果表明，马尾藻多糖具有较好的体外抗炎作用，且其抗炎作用机制可能与其抑制炎症因子IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α、MCP-1等的分泌有关。

关键词：马尾藻多糖；PCV-2；3D4/2细胞；炎症因子

中图分类号： S853.74文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）23-0166-03

收稿日期：2016-06-29

猪圆环病毒Ⅱ型（porcine circovirus type Ⅱ，PCV-Ⅱ）是断奶仔猪多系统衰竭综合征（postweaning mutisystenic wasting syndrome，PMWS）的主要致病原，已成为影响全球养猪业的重大疾病，導致巨大的经济损失。PCV-Ⅱ病毒复制的主要场所是机体的单核-巨噬细胞和抗原递呈细胞，PCV-Ⅱ感染后，病猪体内肺、肝、肾、扁桃体、胸腺、外周血单核细胞、支气管淋巴结、腹股沟淋巴结中均能检测到PCV-Ⅱ病毒核酸[4]，PCV-Ⅱ感染主要表现为淋巴细胞缺失和单核细胞浸润等。本试验就马尾藻多糖对感染PCV-Ⅱ的3D4/2细胞增殖活性及炎症相关细胞因子分泌的影响进行观察，探讨马尾藻多糖抗炎作用分子机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病毒和细胞猪圆环病毒Ⅱ型（SH株）（PCVⅡ）为南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室分离保存，经PK-15细胞增殖后测得病毒滴度为104 TCID50/0.1 mL。猪肺泡巨噬细胞系3D4/2细胞由广西大学动物科学技术学院预防兽医学教研室提供。

1.1.2试验药物马尾藻多糖，广西大学动物科学技术学院药理实验室提供。

1.1.3主要仪器和试剂Multimode Plate Reader多功能酶标仪（TECAN）；RPMI 1640培养液（Gibc）；胎牛血清（Gibco）；噻唑蓝MTT（索莱宝）；小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、白介素-10（IL-10）、巨噬细胞趋化蛋白-1（MCP-1）ELISA检测试剂盒（欣博盛）。

1.2试验方法

1.2.1马尾藻多糖对PCV-2体外感染3D4/2细胞活性的影响分别设置细胞对照组、病毒对照组和6个不同药物浓度组（25、50、100、200、400、800 μg/mL），当细胞密度至1×106 cell/mL时，接至96孔板，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2条件下过夜使其贴壁。细胞对照组加入无血清1640培养液 200 μL，病毒组及药物组加入等量10-1PCV-2病毒液，37 ℃，5% CO2培养箱中吸附2 h，弃去病毒液，PBS缓冲液清洗3次后，细胞对照组、病毒对照组每孔加入100 μL含5% FBS-1640培养液，药物组加入等量不同浓度SP继续培养 8 h，用于检测细胞活性。

1.2.2马尾藻多糖对PCV-2体外感染3D4/2细胞炎症相关因子的影响分别设置细胞对照组、病毒对照组和5个不同药物浓度组（25、50、100、200、400 μg/mL），调节细胞浓度为1×106 cell/mL铺于24孔板中，1 000 μL/孔，37 ℃、5% CO2培养使细胞贴壁。弃上清，细胞对照组加入1 000 μL/孔培养液，病毒组、药物组加入10-1 PCV-2病毒液1 000 μL/孔，37 ℃、5% CO2培养2 h，弃上清，细胞对照组、LPS组、病毒对照组加入1 000 μL/孔培养液，药物组分别加入不同浓度马尾藻多糖，37 ℃、5% CO2培养12 h，收集细胞上清液，用于 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等炎症相关因子的检测。

1.2.3MTT法检测细胞活性按上述处理细胞培养3D4/2细胞8 h后，每孔吸弃10 μL上清，各组细胞每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL），继续培养4 h。培养结束后，弃掉孔内液体，每孔加入100 μL DMSO，摇匀，静置10 min，置酶标仪上测定D570 nm值。

1.2.4ELISA法测定炎症相关因子分泌水平按照上述处理后收集细胞上清，根据ELISA法检测炎症因子（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、MCP-1）分泌水平，严格按照炎症因子（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、MCP-1）测定试剂盒说明进行操作。

1.3数据分析

试验数据采用SSPS 18.0统计软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）。

2结果与分析

2.1不同浓度马尾藻多糖对PCV-2体外感染3D4/2细胞12 h存活率的影响

由图1可见，PCV-2感染3D4/2细胞明显降低细胞活性，与细胞对照组相比差异极显著（P<0.01）；加入马尾藻多糖处理后，50、100、200、400 μg/mL马尾藻多糖能提高感染3D4/2细胞活性，与病毒对照组相比差异极显著（P<0.01）。表明马尾藻多糖能显著提高PCV-2感染3D4/2细胞活性。endprint

2.2不同浓度马尾藻多糖对PCV-2体外感染3D4/2细胞TNF-α分泌的影响

由图2可见，PCV-2感染3D4/2细胞后升高细胞TNF-α水平，与空白对照组相比差异极显著（P<0.01）；加入马尾藻多糖处理后，与病毒对照组相比，25、50、100 μg/mL马尾藻多糖能极显著降低TNF-α水平（P<0.01）；200 μg/mL马尾藻多糖能显著降低TNF-α水平（P<0.05）；400 μg/mL马尾藻多糖能降低TNF-α水平，但差异不显著（P>0.05）。

2.3不同浓度马尾藻多糖对PCV-2体外感染3D4/2细胞IL-1β分泌的影响

由图3可见，PCV-2感染3D4/2细胞后升高细胞IL-1β水平，与空白对照组相比差异极显著（P<0.01）；加入马尾藻多糖处理后，与病毒对照组相比，25、50 μg/mL马尾藻多糖能极显著降低IL-1β水平（P<0.01），100、400 μg/mL马尾藻多糖能降低IL-1β水平，但差异不显著（P>0.05）。

2.4不同浓度SP对PCV-2体外感染3D4/2细胞IL-6分泌的影响

由图4可见，PCV-2感染3D4/2细胞后升高细胞IL-6水平，与空白对照组相比差异显著（P<0.05）；加入马尾藻多糖处理后，与病毒对照组相比，25 μg/mL马尾藻多糖降低 IL-6水平，但差异不显著（P>0.05）；50、100、200、400 μg/mL 马尾藻多糖均能显著或极显著升高IL-6水平（P<0.05，P<0.01）。

2.5不同浓度马尾藻多糖对PCV-2体外感染3D4/2细胞IL-8分泌的影响

由图5可见，PCV-2感染3D4/2细胞后升高细胞IL-8水平，與空白对照组相比差异极显著（P<0.01）；加入马尾藻多糖处理后，与病毒对照组相比，25、50、100 μg/mL马尾藻多糖能极显著降低IL-8水平（P<0.01）；200 μg/mL SP能显著降低IL-8水平（P<0.05）；400 μg/mL马尾藻多糖能降低IL-8水平，但差异不显著（P>0.05）。

2.6不同浓度马尾藻多糖对PCV-2体外感染3D4/2细胞IL-10分泌的影响

由图6可见，PCV-2感染3D4/2细胞后升高细胞IL-10水平，与空白对照组相比差异极显著（P<0.01）；加入马尾藻多糖处理后，与病毒对照组相比，25、50 μg/mL马尾藻多糖能极显著或显著降低IL-10水平（P<0.01，P<0.05），100、200、400 μg/mL马尾藻多糖能降低IL-10水平，但差异不显著（P>0.05）。

2.7不同浓度马尾藻多糖对PCV-2体外感染3D4/2细胞MCP-1分泌的影响

由图7可见，PCV-2感染3D4/2细胞后升高细胞 MCP-1水平，与空白对照组相比差异不显著（P>0.05）；加入马尾藻多糖处理后，与病毒对照组相比，25、50、100、200 μg/mL 马尾藻多糖能降低MCP-1水平但差异不显著（P>0.05）。

3讨论

多糖、皂苷类和黄酮等是中药的有效成分，具有促进细胞生长、参与免疫调节等功效。炎症是机体受到各种致炎因素的刺激和损伤后，为灭活及移除这些致炎因素并为组织修复创造环境而产生的防御性反应，是一种十分常见而又重要的基本病理过程，是许多疾病的症状或并发症，可引起局部或全身性反应。炎症主要由细菌和病毒引起，也可因物理、化学、外伤等刺激而产生[5-7]。在炎症反应中，巨噬细胞起着重要作用，是体内启动炎症介质产生的中心细胞，活化的巨噬细胞是参与炎症反应的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等细胞因子的重要来源[8-9]，为调控炎症反应的主要细胞，由炎症反应所致免疫防御和免疫功能紊乱过程中，巨噬细胞是一个关键的参与者。

在本试验中，PCV-2感染3D4/2细胞后显著促进了TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等炎症因子的分泌，而用马尾藻多糖处理后，25、50、100、200、400 μg/mL马尾藻多糖均在一定程度上抑制了TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、MCP-1等炎症因子的分泌，其中20、50 μg/mL效果较明显。

4结论

马尾藻多糖能显著提高PCV-2感染的3D4/2细胞活性，具有较好的体外抗炎作用，且其抗炎作用机制可能与其抑制炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、MCP-1等的分泌有关。

参考文献：

[1]梁世忠，李兴芳，陈静，等. 马尾藻多糖的抗肿瘤作用及其免疫功能的研究田[J]. 海洋科学，2009，33（3）：49-52.

[2]Sinha S，Astani A，Ghosh T，et al. Polysaccharides from Sargassum tenerrimum：structural features，chemical modification and anti-viral activity[J]. Phytochemistry，2010，71（2/3）：235-242.

[3]刘洪丽，胡庭俊，何颖，等. 马尾藻多糖分离提取及抗氧化活性初步观察[J]. 江苏农业科学，2009（6）：337-339.

[4]Yu S，Opriessnig T，Kitikoon P，et al. Porcine circovirus type 2 （PCV2） distribution and replication in tissues and immune cells in early infected pigs[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology，2007，115（3/4）：261-272.

[5]倪志宇. CCK-8对炎症反应中促炎及抗炎性细胞因子表达的调控机制研究[D]. 石家庄：河北医科大学，2005：168-196.

[6]汪秀，李菲，黄利辉. 油茶籽壳总黄酮对黄曲霉毒素B1致肝细胞氧化应激的保护作用及机制[J]江苏农业科学，2016，44（4）：308-311，577.

[7]范志宇，魏后军，胡波，等. 兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗安全性及效力试验[J]. 江苏农业科学，2015，43（11）：272-275.

[8]Wulster M C，Ajuwon K M，Wang J，et al. Adiponectin differentially regulates cytokines in porcine macrophages[J]. Biochem Biophys Res Commun，2004，316：924-929.

[9]邱海波. 多器官功能衰竭综合征与全身炎症反应综合征[J]. 辽宁医学杂志，2002（16）：113-115.江苏农业科学2017年第45卷第23期钟小仙，刘智微，张建丽，等. 苏丹草-拟高粱杂交种鲜草饲喂獭兔的效果[J]. 江苏农业科学，2017，45（23）：169-171.endprint