一株链球菌的分离鉴定及药敏试验

张颖

2016年11月山东省某猪场发生了一种以出血性败血症、心包积液为主要特征的传染病。该病发病突然，病程急，发病猪出现体温升高、精神沉郁、呼吸困难、结膜发绀，口鼻有泡沫状液体流出及病猪倒地不起等症状，发病急，来不及用药就出现死亡，给发病的猪场造成严重的经济损失。采集死亡病猪肝脾及心包积液等病料经实验室进行细菌分离培养、革兰氏染色、生化特性鉴定、玻片凝聚试验、药敏试验及动物回归试验，并经PCR检测确定为猪链球菌感染。现报告如下：

1材料与方法

1.1主要试验材料

病料为从山东省几个猪场采集的疑似猪链球菌感染的病猪病料，体重为18～20g的健康小鼠购自河南大学实验动物中心。

1.2主要试剂

TaqDNA聚合酶、dNTPs及DNA Marker DL2000等购自大连宝生物工程有限公司；胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。改良马丁肉汤培养基、琼脂粉等试剂购自北京索莱宝科技有限公司；猪链球菌的标准阳性血清、药敏纸片购自北京天坛生物公司；细菌生化反应管购自杭州天和微生物试剂有限公司；其他化学试剂如氯仿、异丙醇和乙醇等，均为国产分析纯产品。

1.3细菌的分离培养

无菌取发病猪的肝脏及心包积液用接种环划线接种于含5%绵羊血的马丁肉汤琼脂平板上，放置于37℃的C02培养箱中培养24～48h，观察生长情况及菌落特征。挑取疑似菌落涂片并进行革兰氏染色，镜检。观察细菌形态及溶血情况。

1.4细菌的生化鉴定

将所分离细菌纯化培养后接种于马丁肉汤琼脂平板上，放置于37℃的C02培养箱培养36h，观察是否有溶血现象。挑取生长良好的单菌落转移接种于各个微量生化反应管，根据杭州天和微生物试剂有限公司说明书进行，观察生化反应特性，鉴定结果。

1.5玻板凝集试验

将分离鉴定的疑似猪链球菌的分离菌落接种改良马丁肉汤培养基，37℃的C02培养箱培养24h，取1.0mL培养菌液，4，000r/min离心5min，弃上清，用适量PBS悬浮沉淀，取20μL悬浮菌液与等体积的无菌PBS、猪链球菌2型阳性血清进行玻片凝集试验，同时设PBS空白对照进行阴性对照。

1.6药敏试验

无菌条件下对分离细菌培养物利用K-B纸片扩散法进行药敏试验，将分离的猪链球菌接种在改良马丁肉汤培养基中，培养后无菌挑取单菌落后均匀涂布普通琼脂平板，用灭菌镊子夹取青霉素、阿莫西林和红霉素等各种药敏纸片贴在适当的位置，将培养皿置于37℃培养24h观察测定抑菌圈的大小，判断对不同药物敏感性。

1.7细菌的致病性动物回归试验

将纯化的分离菌、增菌接种到改良马丁肉汤培养基中培养12～24 h制成细菌悬液，接种8只健康的健康小白鼠，随机分成2组，每组4只，第1组小鼠腹腔注射0.5mL/只，第2组腹腔注射马丁肉汤培养基作为对照组。观察实验小鼠的发病情况，剖检死亡小鼠观察病理变化，取病料镜检。

1.8细菌的PCR鉴定

从GenBank中猪链球菌序列，参照文献中16srRNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物大小为1，150bp，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2结果与分析

2.1細菌的分离培养

取病变肝脏研磨后接种培养基37℃培养36h后，观察菌落特征，其表面光滑湿润，边缘有整齐的乳白色圆形小菌落，且有显著溶血环。革兰染色镜检可见呈链状排列的革兰氏阳性球菌。

2.2细菌的生化鉴定

本实验生化试验结果表明：分离的链球菌糖发酵特性活泼，能发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖、果糖和蔗糖等，产酸不产气；且该分离菌不能发酵木糖、半乳糖、甘露和山梨醇等；氧化酶试验、过氧化氢酶试验为阴性，甲基红试验、亚甲蓝还原试验结果呈阳性。

2.3玻板凝集试验结果

分离的链球菌与购买的猪链球菌标准阳性血清玻板凝集试验结果为阳性，阴性对照无凝集。

2.4药敏试验结果

试验结果：该分离株链球菌对不同抗生素药物的敏感程度不同，该菌株对氨苄西林、青霉素、诺氟沙星和头孢噻肟高敏；对环丙沙星、氧氟沙星和庆大霉素中敏；而对林可霉素和链霉素不敏感，具有耐药性。

2.5细菌的致病性动物回归试验

将分离的链球菌腹腔接种健康小鼠后，第1组小鼠出现神经症状，均在24～72h内死亡，对照组小鼠无明显临床症状。剖检死亡小鼠出现出血性败血症、心包积液等特征，颌下及腹股沟淋巴结肿大。取其心包积液涂片染色镜检为革兰氏阳性球菌。2.6分离菌的PCR鉴定

提取分离菌株的DNA为模板，以不加模板为阴性对照，通过特异性的16srRNA通用引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳可见1，150bp左右的特异条带，与预期目的条带位置一致，阴性对照未见条（图1）。

3讨论

近年来，随着世界养猪业集约化发展，猪链球菌病呈上升趋势，已成为严重影响养猪业的典型细菌性疾病，给我国养猪业的发展造成了巨大的经济损失，同时该病作为人畜共患传染病还给公共卫生安全带来了严重威胁。根据临床症状、典型病理变化以及病原菌的分离鉴定可以进行副猪嗜血杆菌感染的诊断。本试验中分离的病原菌从培养特性、染色镜检、溶血特性及生化特性等都符合猪链球菌的生物学特性。将分离菌的培养产物接种小鼠，出现该病

典型症状，动物回归试验证实该菌具有较强的致病性，同时PCR检测证实了该分离菌为猪链球菌。endprint