猪内源性反转录病毒在异种移植中的研究进展

邱艳，陶开山，李霄，张卓超，窦科峰（.空军军医大学西京医院肝胆外科，全军器官移植研究所，陕西 西安 7003；.中国人民解放军总医院第一附属医院，肝胆胰脾外科，北京 00853）

供体短缺是器官移植面临的最大问题，绝大多数终末期脏器功能衰竭患者因缺乏供体器官而死亡。器官共享联合网络（United Network for Organ Sharing，UNOS）数据显示，截止2018年3月在美国有114 965个人排队等待器官移植，在这些人当中有74 816人亟需进行移植［1］。2018年1月完成了2 853例器官移植，然而仍有600例等待移植的患者死亡［2］。

开展异种移植研究，用动物器官代替人类器官进行移植，是目前解决器官短缺的重要途径。而猪是目前公认的异种移植研究的最佳供体，它有着易繁殖、器官大小和功能与人类似的优点［3］。当猪的器官移植到受体身上时，猪身上所携带的某些病毒有可能会传播给灵长类动物。猪身上携带的猪巨细胞病毒（PCMV）和猪淋巴疱疹病毒（PLHV）在很大程度上是物种特异性的，通常不会感染人类细胞［4］。但是对于典型的哺乳动物C型反转录病毒——猪内源性反转录病毒（PERV）是否会在种间传播存在未知性。

1 PERV病毒的生理特性

PERV是一种感染性反转录病毒，能够整合到宿主生殖细胞的基因组中［5］，PERV是一种永久性的C型反转录病毒［6］，它在猪的组织中均有表达，在肾脏中表达量最高，胰腺中表达量最低［7］。病毒在细胞或者机体内通过反转录酶的作用以RNA为模板合成DNA从而感染宿主［8-9］。PERV病毒的起源有可能是鼠的反转录病毒［10］。PERV基因组由3部分构成：群特异性搞原（gag）、聚合酶（pol）和膜基因（env）。在前病毒阶段，这三个基因靠长末端重复序列（LTR）连接在一起，这个序列包括了启动子、增强子和调控子。gag基因编码结构蛋白，包括衣壳，核衣壳和基质；pol基因编码反转录酶、核糖核酸酶、整合酶和蛋白酶；env基因编码跨膜蛋白（TM）和表面膜蛋白（SU）［11-12］。在膜蛋白表面有一个受体结合域，这个结合域的不同决定了PERV病毒的亚型［13］。PERV病毒分为PERV-A、PERV-B、PERV-C三种亚型；PERV-C并非存在于所有猪中且是一种嗜亲性病毒，只会感染猪的细胞，而PERV-A和PERV-B存在于所有猪的基因组中，是多嗜性病毒，有可能感染人的细胞［14-15］。反转录病毒具备重组特性，这在病毒进化过程中发挥着重要作用，并且增加了病毒的多样性［16］。PERV-A 和 PERV-C重组形成新的PERV-A/C分型，PERV-A/C具有高滴度复制的特征，而且能够感染人类细胞，而且重组后的病毒是整合到猪的体细胞中而不是生殖细胞中［17］，这大大增加了感染的风险。但是有专家认为虽然PERV-A/C存在风险，但是PERV-C并不是存在于所有的猪中，因此选择不携带PERV-C的猪作为供体就可以避免PERV-A和PERV-C的重组［18］。针对PERV病毒的检测，一般检测的是：① 细胞中的原病毒滴度；② 病毒的mRNA的表达水平；③ 病毒表达的蛋白水平；④ 病毒本身的一些产物，我们可以用实时荧光定量、印记杂交、荧光原位杂交等方法检测反转录病毒［19］。

2 PERV病毒的研究历史

1997年英国伦敦癌症研究所的Clive Patience和Robin Weiss在猪细胞和人细胞的共培养中发现PERV可以在体外感染人体细胞［20］。在此之后哈佛医学院的Fritz Bach教授呼吁禁停异种移植，他认为PERV病毒不仅仅会感染受体，还会感染普通人群［21］。同年，因为PERV传播的推论，美国食品和药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）无法评估这个风险而禁停了所有相关实验，直至1998年，FDA要求研究人员监测接受猪组织治疗的受体体内的PERV病毒才解除了这个禁令［22］。2000年美国斯克里普斯研究所的van der Laan等［23］在Nature上发表一篇文章，文章中的实验结果表明猪胰岛产生的PERV病毒能感染人细胞，并且将猪胰岛移植到免疫缺陷小鼠体内后能持续检测到病毒的表达，这是PERV病毒跨物种感染的第一个证据。当时的研究人员对于PERV的研究不仅仅停留在动物模型上。英国剑桥的研究团队就在1999年进行了大型临床研究，他们研究了160例在12年前接受过各种活体猪组织治疗的患者，包括体外脾灌注、体外肝灌注、猪皮肤组织移植、猪胰岛细胞移植等。共收集了160例患者的样品对样本中PERV病毒的DNA、搞PERV病毒搞体、PERV病毒的RNA等进行了检测分析，分析的结果表明没有任何决定性的证据证明PERV病毒能在种间或者人与人之间传染。在他的研究中也包括了进行免疫抑制治疗的患者，因此也排除了免疫抑制增加感染风险的可能。但是在这个实验中发现了23例患者在长达8.5年中存在着微嵌合体［24］。嵌合体在体内长时间的存在增加了传播隐患，斯克里普斯研究所在2004年发表的文章中对嵌合体进行了分析，他们将猪和人的淋巴造血组织移植至免疫缺陷的NOD/SCID转基因小鼠体内，分析PERV病毒是否在人体细胞内传播，他们的结果并未观察到PERV的传播，他们认为在嵌合体检测到的PERV序列可能是由于嗜异性小鼠白血病病毒对PERV-C病毒的假型包装引起的，而不是变成人嗜性的PERV病毒。作者认为这也解释了之前PERV在小鼠体内发生种间传播的问题。PERV由于并未检测到人嗜性PERV病毒，因此Yang认为应用猪进行异种移植引起物种感染的风险性并不高［25］。

3 PERV的预防策略和研究进展

虽然前期的实验数据没有对PERV的种间传播提供明确的理论依据，但是微嵌合体的存在会对人体造成新的潜在风险，更何况人的人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）就来源于猿类免疫缺陷病毒的种间传播［26-27］。除此之外，人T淋巴细胞白血病病毒-1（HTLV-1）和人T淋巴细胞白血病病毒-2（HTLV-1）也是由非人类灵长类动物传播给人［28］。这些病毒传播的先例更是引起了人们对PEVR病毒物种间传播的担忧，并且之前也有研究者用荧光素酶双报告基因检测揭示了重组PERV末端含有核因子Y结合位点的重复序列的长度会增加，使得病毒滴度增加与转录速率增加，这些数据都表明PERV有感染人类细胞的可能性，甚至可能会有更高效率的复制［29］。寻找合适的预防PERV传播的方法变得很重要。

3.1 非基因编辑手段：因为PERV存在不安全因素，有学者尝试寻找搞反转录病毒的药物抑制病毒的表达来减少感染的可能性。搞反转录病毒的药物大致分为5类：① 核苷类反转录酶抑制剂；② 核苷酸类反转录酶抑制剂；③ 非核苷类反转录酶抑制；④ 整合酶抑制剂；⑤ 蛋白酶抑制剂［30］。其中反转录酶抑制剂中叠氮胸苷、脱氧胸苷、阿德福韦和替诺福韦被证实对PERV有效，叠氮胸苷是4个抑制剂中对PERV抑制效果最好的［31-32］。现暂未发现蛋白酶抑制剂类的药物对PERV有抑制作用，而整合酶抑制剂中雷特格韦和度鲁特韦也能抑制PERV的表达［33］。研究人员试图通过研究搞反转录病毒的药物来控制供体体内PERV的表达，同时也是为可能的种间传播寻找治疗策略。除了搞反转录病毒的药物研究，罗伯特·科赫研究所艾滋病毒和反转录病毒研究中心对PERV的疫苗也进行了研究，但是实验的对象暂时限于山羊、仓鼠等动物［34］。

3.2 基因编辑手段

3.2.1 锌指核酸酶（ZFN）技术：基因编辑的手段获得不携带PERV病毒的猪是一个新的研究方向。德国的Semaan等［35］用锌指核酸酶（ZFN）技术靶向的与猪细胞中PERV基因保守的序列特异性结合，促使病毒双链的断裂，这刺激了细胞天然的DNA修复过程，即通过同源重组和非同源末端加入，从而消除猪基因中的PERV。他们观察到在猪细胞中能表达PERV病毒的细胞核内ZFN高表达，遗憾的是他们发现ZFN在细胞核中表达后转染的细胞就会发生凋亡的现象。这是因为这种修复会导致基因的插入、删除从而导致基因的失活和不稳定性。这个基因编辑方法的失败使得研究人员开始寻找其他的方法。

3.2.2 CRISPR/Cas9技术：2015年 Yang等［36］在Science杂志上发表文章中提到他们成功的使猪基因中的多种PERV病毒失活。他们首先确定了PERV病毒在猪肾上皮细胞系（PK15）中的拷贝数为62，然后用转位子或者病毒将CRISPR/Cas9转入PK15猪细胞中，使得CRISPR/Cas9整合并且剪切细胞基因中的PERV病毒基因保守区域阻止PERV病毒的拷贝，从而成功地使猪基因中多种PERV病毒前体病毒失活。他们共培养了人细胞和CRISPR/Cas9处理过的PK15细胞，并以未做处理的猪细胞与人细胞共培养作为为对照，结果证明处理过的PK15细胞能有效地将PERV对人细胞的传染减少1 000倍以上。在当时有人认为这个实验虽然获得了PERV失活的PK15细胞，但是能否成功获得存活的PERV失活猪还是个未知数，获得PERV失活猪需要进行体细胞核移植，而原代细胞的PERV失活是否如在PK15中一样容易，并且PERV病毒被证实在猪胎盘的发育中有着重要的作用，这些问题都是需要克服的［37-38］。2017 年，Niu 等［39］在新刊出的文章中提到他们已经成功地将猪胚胎成纤维细胞中的PERV前病毒失活，针对最初无法获得高存活率的PERV失活猪胚胎成纤维细胞的问题，他们在用CRISPR/Cas9处理猪胎儿成纤维细胞时加入了搞凋亡的混合制剂，从而使得PERV失活猪胎儿成纤维细胞的存活率大大提升。并用体细胞核移植（SCNT）的方法获得了猪胚胎，将其植入代孕母猪体内，他们成功的获得了PERV失活猪，这是一个突破性的进展。他们同时用PK15细胞和人胚肾细胞在体外验证了PERV病毒在种间的传播，同时也验证了人细胞之间的PERV传播，验证了获得PERV失活猪的意义。

4 展 望

PERV的存在阻碍了异种移植应用于临床。从发现PERV和人细胞共培养会发生传播现象开始，即便也有研究一直证明PERV病毒在人体内是不具备传染性的，但很多研究者都开始对PERV进行了深入的研究寻找预防策略。PERV的易突变型使搞反转录的药物和疫苗的效果受到一定的限制，而锌指核酸酶技术使得基因不稳定导致基因编辑失败，CRISPR/Cas9技术的出现获得了PERV失活猪，给控制异种移植中PERV传播带来了新的可能。PERV失活猪的产生推动了异种移植的发展，但是这些PERV失活的猪作为供体移植到人体内时是否会造成其他的影响还需要更多证据和更深入的研究。只有彻底消除PERV病毒的隐患才能让公众接受异种移植，使异种移植运用于临床，让异种移植为终末期器官衰竭患者提供生的希望。