异种肝移植的研究进展

2018-01-29窦科峰李霄杨佩军陶开山空军军医大学第一附属医院肝胆外科暨全军器官移植研究所陕西西安710032

实用器官移植电子杂志 2018年5期

窦科峰，李霄，杨佩军，陶开山（空军军医大学第一附属医院肝胆外科暨全军器官移植研究所，陕西西安 710032）

随着肝移植技术逐渐成熟，供肝短缺的问题日益突出。据美国器官资源共享中心（United Network for Organ Sharing，UNOS）的数据显示，美国平均每年实施约8 000例肝移植手术。但与此同时，每年约有1300例患者在等待肝脏的过程中死亡，还有1500例等待肝移植的患者因错过最佳移植时间而从等候名单上被移除［1］。我国的形势则更为严峻，等待移植与供肝比例高达150∶1，绝大多数患者因缺乏供肝而死亡［2］。加强公民死后器官捐献的宣传、扩大心脏死亡器官捐献（donation after cardiac death，DCD）数量，推广活体肝移植、劈裂式肝移植技术，发展生物人工肝技术、培育人源化肝脏等，都是扩大供体来源、缓解供体短缺的有效方法，但目前效果还比较有限，短期内无法突破供体短缺的困境。

以猪为供体的异种肝脏移植在此背景下应运而生。当前，异种肝移植主要考虑应用于急性暴发性肝衰竭患者，在其等待同种供肝的过程中能够维持患者的肝功能，以发挥“桥接过渡”治疗的作用［3］。和非人灵长类动物相比，以猪作为供体具有很多优势。首先，猪易于饲养、繁殖快、成本低，且与人类的解剖结构、生理状态近似；其次，对于猪的组织配型和基因修饰，目前已有成功的经验和技术，因而猪是理想的异种移植供体来源［4］。

自1968—2012年，猪到非人灵长类动物肝移植最长存活时间仅为9天，造成受体死亡的主要原因是移植后的超急性免疫排斥反应（hyper acute rejection，HAR）。随着α-1，3-半乳糖苷转移酶（α-1，3-galactosy transferase，GGTA1）基因敲除（galactosyltransferase gene knockout，GTKO）小型猪的出现，HAR已基本得到控制，但随后发生的血小板减少症、血栓性微血管病变和致死性凝血调节功能障碍，成为造成受体死亡的主要原因［5］。近年来，在术后补充外源性凝血因子或联合共刺激通路的阻断，有效延长了异种肝移植受体的存活时间，异种肝移植已具备进入临床试验的基本条件。在此背景下，本文试就猪到非人灵长类动物的异种肝移植的研究进展进行综述，并展望其不久后在临床中的应用价值。

1 异种肝移植的大动物试验研究

1.1 以野生型猪为供体的异种肝移植试验：1968年，Calne进行了第一次以猪为供体的异种肝移植的大动物实验。在7例野生猪到狒狒的异种肝移植中，受体最长存活时间为3.5天，存活最长的受体应用糖皮质激素和硫唑嘌呤的免疫抑制方案，尸检提示狒狒死于支气管肺炎，肝脏病理显示部分肝细胞存活，但汇管区有大量免疫炎性细胞的浸润。两年后，又进行了以恒河猴和大猩猩为受体的再次尝试，但结果仍不理想，受体存活时间均没有超过12小时，死亡原因为弥漫性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）。在接下来的20年里，研究者以野生猪为供体进行了多次尝试，但存活期始终没有超过3天。这一阶段的异种肝移植研究均以失败告终。

1.2 以基因修饰猪为供体的异种原位肝移植试验：上述实验表明，由于物种间的不相容性，异种肝移植术后存在严重的HAR，导致受体存活时间较短。随之发现HAR 是由灵长类动物体内预存的抗α-1，3-半乳糖（α-1，3-galactosy，α-1，3-Gal）的异种反应性天然抗体，与广泛表达于猪血管内皮细胞上的α-1，3-Gal抗原结合，随后激活补体和内皮细胞，导致凝血级联反应，在数分钟到数小时内出现以间质出血、水肿和小血管血栓形成为主要表现的免疫排斥反应。随着基因编辑技术的发展，转人补体调节蛋白或敲除天然抗原的基因修饰小型猪不断问世，异种肝移植研究进入了快速发展阶段［6］。

2000年，Ramirez实施了第一例以基因修饰猪为供体、狒狒为受体的原位异种肝移植。供体猪表达人补体调节蛋白——衰变加速因子（human complement regulatory decay accelerating factor，h-DAF or CD55），显著激活受体的补体调节功能，限制补体活化的强度，有效控制HAR 程度，狒狒术后存活时间达到8天，移植后的肝脏能够在受体内合成正常水平的有效凝血因子。该实验中存活时间最长的狒狒后期出现严重的脓毒症，因此执行了安乐死。此后，Ramirez 又在供体内转入人补体调节蛋白CD59 和α-1，2-岩藻糖转移酶，虽然多基因修饰后的供肝在术后没有出现明显的超急性排斥并保持完整的肝脏结构，但受体存活时间仅为13～24小时，其中3例受体出现内出现血栓，1例受体出现不明原因的移植物失功能，这项研究宣告失败。

除了在供体内引入新基因，基因工程研究者还成功敲除了供体内导致HAR的抗原基因。进化上处于旧世界猴之前的哺乳动物（包括猪）都会表达半乳糖抗原表位，而旧世界猴以后的哺乳动物（包括人）体内存在抗半乳糖的天然抗体。2002年和2003年，美国的两个研究团队先后在Science和Nature上报道培育出GTKO猪。随后全世界开展了一系列以GTKO猪为供体，非人灵长类动物为受体的异种肝移植试验，带来了令人鼓舞的研究结果。Cooper等［7］和 Ekser等［8］首次应用转入 hCD46的GTKO 小型猪作为供体，实施异种肝移植，术后受体存活4～7天，且具有正常的蛋白合成功能，狒狒外周血中持续检测到猪源白蛋白、纤维蛋白原、结合珠蛋白、纤溶酶原和凝血因子。但术后数小时受体即出现较为严重的血小板减少症，并最终因严重的腹腔出血而死亡。Kim等［9］调整免疫抑制方案后，受体存活时间延长至9天。存活时间最长的2例受体术后持续应用溶血酶抑制剂氨基己酸，抑制了受体内纤维蛋白溶解，将血小板维持在40000/mm3。这些受体虽未出现致死性的血小板减少症，但白细胞计数的持续升高和红细胞、血小板计数的持续下降仍提示受体存在凝血功能障碍和脓毒血症，并最终导致受体死亡，尸检结果提示移植肝脏内未出现明显的急性细胞和体液免疫排斥反应。

1.3 以基因修饰猪为供体的异种异位肝移植试验：2013年，第四军医大学第一附属医院全军器官移植研究所完成我国首次猪-猴异种肝移植大动物试验。供体是中国农业科学院北京畜牧兽医研究所培育的GTKO小型猪，血型为O型。受体是四川医学科学院实验动物研究所培育的藏酋猴，血型为A型。手术先切除藏酋猴的脾脏，而后将GTKO猪的部分肝脏植入脾窝，行受体左肾静脉远端与移植肝门静脉吻合、受体左肾静脉近端与移植肝肝静脉吻合、受体脾动脉与移植肝肝动脉吻合，并放置胆道引流管。术后采用“吗替麦考酚酯胶囊+他克莫司+注射用巴利昔单抗+激素”的四联免疫抑制方案，并应用丹参抗凝。术后受体胆道引流管内有金黄色透明胆汁持续流出，量为40～50 ml/d。肝功等生理、生化指标逐渐恢复至生理范围，未发现肝功能损害现象。凝血功能和血小板数量保持稳定，未出现凝血系统功能紊乱、DIC等病理改变［10］。酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测到受体血液中有猪源白蛋白和血小板活化因子存在，证明移植肝脏发挥正常的生理代谢功能，与猴子的自身肝脏“相互支持、和谐共存”。受体和移植肝脏存活2周，最终因长期卧床导致坠积性肺炎、呼吸衰竭、心力衰竭而死亡。尸检发现移植肝脏形态良好，颜色红润，体积明显增大，质量约300g；病理检查未发现超急性和急性免疫排斥反应发生。

这项研究不仅是亚洲首例猪-猴异种肝移植试验，也是世界首例异种异位脾窝辅助性肝移植术，创造了当时GTKO猪-非人灵长类动物异种肝移植受体最长存活时间记录。与国外研究的异种原位肝移植术（切除受体肝脏后原位植入猪肝，并切除脾脏以控制免疫排斥）相比，该术式不损伤受体自身肝脏，在切除受体脾脏后，巧妙地将脾窝做为移植肝脏的“新家”。这不仅有利于控制免疫排斥反应、促进受体肝功能恢复，并能帮助维持正常的凝血和抗凝功能，防止发生凝血系统功能紊乱，避免出现异种肝移植术后常见的血小板匮乏和致命的广泛性内脏出血［11］。当然，这些优势还需要大样本量的动物试验和基础研究进一步明确和证实。

在此基础上，该研究小组还在世界上首次建立了永生化的GTKO猪肝细胞系HepDW细胞。该细胞目前已稳定传代至30代，其表面不表达Gal抗原，具备合成、分泌糖原和白蛋白的能力，并表达肝细胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α）、细胞色素CYP3A、谷氨酰胺合成酶、谷胱甘肽转移酶等肝细胞发挥代谢及功能的重要分子。在其培养上清中可检测到尿素、谷丙转氨酶、谷草转氨酶的分泌，说明该细胞具有氨代谢能力。该细胞具有正常猪肝细胞的全部功能且不表达Gal抗原，以其为基础，可在体外构建模拟异种移植肝病理变化的细胞模型，为研究移植肝损伤机制、筛选抗排斥药物方案提供良好的体外实验基础。

2014年，美国麻省总医院也进行了相同的异种异位辅助性肝移植试验，术后采用“激素+他克莫司”的免疫维持方案并补充外源性全谱系凝血因子。术后移植肝和受体存活15天，最终死于肝功能衰竭和感染［12］。该小组在2016年，又完成了6例GTKO小型猪-狒狒原位肝移植手术实验，术后仍然补充外源性全谱系凝血因子，最终移植肝和受体存活25天［13］。

1.4 补充外源性人凝血因子对缓解凝血功能障碍作用：凝血功能障碍是异种肝移植术后，受体不可避免出现的病理过程，表现为血小板减少、出血、血栓性微血管病变。目前认为，导致凝血功能障碍的主要原因是受体外周血中的抗非半乳糖抗体激活了移植肝脏内的血管内皮细胞，从而引发凝血级联反应。此外，猪和非人灵长类动物的凝血因子种类及活性有较大差距［14］。有研究证实，异种肝移植术后受体狒狒体内无法检测到猪源性的凝血因子Ⅶ，而狒狒自身残存的凝血因子Ⅶ也仅能在术后24小时内检测到，这提示凝血因子Ⅶ的缺乏与凝血调节功能障碍有密切关系。基于这些发现，有研究者尝试在术后早期给受体补充人源性的凝血因子，以解决移植术后的凝血功能障碍。试验中尝试了两种药理作用不同的药物，分别是含有因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ以及蛋白C、蛋白S的第二代人源性凝血酶原复合物浓缩物Octaplex（human prothrombin complex concentrate，hPCC）和重组人活化因子Ⅶ。当静脉推注hPCC时，导致移植物血管中血栓形成，2例实验受体仅存活1天和3天。但在另外4例hPCC连续给药的受体中，术中输血需求大大减少，术后病理提示未发现血栓性微血管病变。实际上，在连续给药的情况下，受体只需输注200 ml血液即可存活1周，而在过去的猪-狒狒异种移植中受体存活同样的时间需要输注约600 ml 血液。此外，研究者还发现，补充人源性的凝血因子后，受体的血小板数量能够维持稳定甚至有所回升［15］。

1.5 阻断受体共刺激通路，降低免疫排斥反应：在上述研究基础上，Shah等［16］借鉴异种肾移植和心脏移植长期存活的经验，拟定了一套完整的猪-猴异种肝移植方案：使用不携带巨细胞病毒的GTKO猪作为器官来源，移植后补充人源性凝血因子，并应用抗CD40的单克隆抗体以阻断受体共刺激通路的活化。以该方案实施了4例猪-狒狒的异种肝移植，受体给予hPCC连续给药，采用抗胸腺细胞球蛋白诱导，他克莫司、甲泼尼龙、贝拉希普（n=3）或抗CD40单克隆抗体（n=1）维持治疗的免疫抑制方案。4只狒狒异种肝移植后输血需求明显减少，且最长存活了29天，这也是目前异种肝移植受体的最长存活时间［16］。该研究表明异种肝移植物可以在非人灵长类动物体内维持其肝脏代谢功能，可以考虑将其用于急性肝衰患者接受同种肝移植之前起到过渡作用。

2 异种肝移植临床试验研究

1992年10月11日，在无合适同种供肝的情况下，美国洛杉矶西代细纳医院的Makowka 为1例因自身免疫性肝炎所致暴发性肝功能衰竭的3～4级肝昏迷患者实施辅助性肝移植（右肝下），供肝来自野生型的尤卡坦猪（体重20kg），意图做暂时的过渡性治疗，使患者能够度过危险的肝昏迷期［11］。术前采用血浆洗脱法和特异性抗体移出法对患者进行预处理，清除了受体循环血液中90%的抗猪天然抗体，减轻HAR。术后采用“环孢素A+环磷酰胺+前列环素E1+硫唑嘌呤”的四联免疫抑制治疗方案。手术获得了成功，术后6小时后看到金黄色的胆汁不断流出，除了中枢神经系统，各个器官系统的功能都有明显的改善。受体乳酸清除率改善、凝血酶原时间稳定、血清胆红素和转氨酶水平下降，都提示异种肝脏发挥了一定的功能。同时，受体颅内压持续下降，凝血功能也逐渐转向正常。但令人惋惜的是，在合适的人供肝到来前2小时，患者脑压突然迅速回升，最终因发生小脑脑疝而导致死亡。最终，供肝有功能存活20小时，受体存活34小时。尸检发现移植肝脏内有抗体和补体成分沉积，肝动脉、中心静脉、门静脉出现广泛的出血性坏死和多个不同血管的大量闭塞性血栓形成，内皮细胞肿胀明显，发生了抗体介导的HAR所致的大面积肝组织梗死，提示受体循环血液内的异种抗体清除后可迅速形成大量的新的抗猪抗体。

这是目前仅有的1例以猪为供体的临床异种肝移植实验，虽然结果不理想，但最为重要的是证明了猪的肝脏可在人体内发挥一定的代谢功能，能够为急性肝功能衰竭患者提供一段时间的肝功能支持，从而起到“桥接”同种肝移植治疗的目的［17］。

3 临床试验展望

随着异种肝移植动物实验存活时间的不断延长，异种肝移植越来越接近临床试验，但要开展安全、有效、符合伦理的临床试验，关键的问题是选择合适的受者。笔者考虑，初期临床试验应主要选择急性暴发性肝功能衰竭、早期移植肝失功能及慢性肝病急性失代偿的患者。这些患者无法及时获得肝源，同时也缺少其他可以替代的有效治疗方法，如果不接受肝移植，病死率高达80%。据统计，急性肝衰患者在死亡前登记在等候名单上的平均时间只有3天，而对于成功的接受了肝移植手术的急性肝衰患者，接近2/3的人存活时间可超过2年［18］。因此，可以尝试将异种肝移植作为桥接，延长这类患者的生存时间，直到得到合适的肝源进行同种肝移植。而在这个过程中，如能证实异种肝移植的安全性和有效性，异种肝移植可最终作为终末期肝病的有效治疗手段应用于临床。