环状RNA及其在畜禽中的研究进展

吴　艳，潘爱銮，杜金平，皮劲松，梁振华，申　杰，张　昊，蒲跃进，孙　静

(1. 湖北省农业科学院 畜牧兽医研究所 湖北省农业科技创新中心，武汉　430064；2. 动物胚胎工程与分子育种湖北省重点实验室，武汉　430064)

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类新发现的内源性非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)，最早于1976年在某些高等植物中被发现[1]。与传统的线性RNA(linear RNA，含5′和3′末端)相比，circRNA的不同在于其5′和3′端以共价键连接在一起呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定、不易降解[2]。近几年的研究结果显示circRNA在调控人类基因中展现出巨大的潜能[3]，使其成为RNA领域最新的研究热点。早期的研究认为，circRNA是正常的编码RNA剪接发生错误而导致的产物[4]，但随着研究的深入，这种观点已经发生改变。已有研究表明，circRNA主要通过称之为反式剪接的过程产生，在此过程中，下游的外显子同上游的外显子发生反向剪接，即一个剪接受体与主转录本上游的剪接供体相结合，形成一个环形的副本；在各种不同类型的动物和植物细胞中，circRNA来源于蛋白质编码基因和非编码基因[5]。在哺乳动物中的研究证明，circRNA来源于蛋白质编码基因的外显子并且发挥miRNA(microRNA)海绵的作用[6]。最新研究发现，在动物体内RNA的环化与前体mRNA的剪接存在竞争抑制关系，以此来保持组织特异性基因的表达[7]。然而circRNA的主要作用仍不清楚。本文主要综述circRNAs的来源、特征、形成机制、主要功能、研究方法及其在畜禽中的研究进展，并对circRNA在畜禽中的研究前景进行展望，为进一步研究circRNAs提供一定的理论基础与技术支撑。

1　circRNA的形成机制

circRNA在真核生物中主要通过一种反向可变剪接，使基因的外显子序列反向首尾连接形成环状RNA。其形成方式包括外显子来源的circRNA(exonic circular RNA)、内含子来源的circRNA(intronic circular RNA)及由外显子和内含子共同组成的circRNA(exonic -intronic circular RNA, ElciRNA)。

1.1　外显子来源circRNA和ElciRNA的形成机制

关于exonic circRNA 和ElciRNA的形成机制主要有3种：直接反式剪接、外显子跳跃和内含子配对驱动的环化。直接反式剪接是由同一个外显子下游的3′端和上游的5′端相结合，使下游的供体与上游的配体配对，从而使外显子环化形成circRNAs；外显子跳跃需要通过内含子跳读产生一个包含外显子的套索，套索内部通过拼接将内含子切除从而产生circRNAs[8]；内含子配对驱动的环化是位于两个外显子侧翼的内含子之间存在互补序列，其可直接通过碱基配对诱导环化形成circRNA。此外，有研究表明，RNA通过侧翼内含子与个体内含子形成配对竞争，以保证外显子环化的效率[9]；环化剪接和线性剪接之间存在竞争，从而使circRNAs具有基因调控的功能[10]。

1.2　内含子来源circRNA的形成机制

根据内含子剪接机制的不同，可将内含子分为自我剪接内含子、酶促剪接内含子及核mRNA前体内含子。其中，自我剪接内含子可分为Ⅰ类内含子、Ⅱ类内含子，机体内的内含子circRNAs主要由这两类内含子剪接而成。Ⅰ类内含子参与常规剪接：结合在内含子上的一个外源鸟苷作为亲核体与5′剪接位点相作用，从而形成环状RNA；Ⅱ类内含子介导的circRNA的形成：环状的形成需要3′端外显子释放，内含子末端的3′-OH攻击5′碱基位点，2′-5′磷酸二酯键形成从而产生一个环状RNA[11]。

2　环状RNA的特征与主要功能

2.1　环状RNA的特征

由于早期研究技术限制，只有少数环状RNA被发现，丰富性较低。近年来的研究发现，在多种生物细胞和组织中，有超过10%的表达基因能够产生circRNA[12]，表明circRNA是一类古老、在真核基因中保守的分子[13]。此外，circRNA还具有以下特征：大部分属于非编码RNA[14]；主要由外显子衍生而来[15]；同一基因位点或许可通过选择性环化产生多种circRNAs[16]；比线性RNA稳定，不易降解[17]。circRNA的这些特性表明其具有重要的生物功能。

2.2　circRNA的主要功能

近年来的研究表明circRNA具有较高的丰富性，但是其生物学功能仍需不断研究。目前，circRNA的功能主要包括以下几个方面：

2.2.1miRNA海绵作用miRNA是一类长度在21 nt左右的RNA，它们可以通过碱基互补配对直接与mRNA靶标相结合，从而起到抑制mRNA翻译的作用[18]。由于circRNA拥有miRNA结合位点，其可以通过吸附特定的miRNA，竞争性抑制miRNA与靶标结合的能力[19]。已有的研究证明，大多数circRNA具有多个miRNA结合位点[3,20]，但circRNA是否普遍具有miRNA海绵作用还有待进一步验证。

2.2.2调节转录、参与蛋白合成circRNA除能够调控miRNA外，还可与RNA结合蛋白相结合形成 RNA蛋白复合物，对RNA结合蛋白和miRNA起调节作用或者通过部分碱基互补配对直接作用于靶基因[21]。Chen等[22]研究证明circRNA具有编码蛋白质的功能。由于circRNA没有ploy(A)尾的结构，不易从尾端被降解，从而证明circRNA在调控RNA转录和蛋白质合成上可能具有关键性的作用[23]。此外，有研究表明circRNA还具有存储、定位RNA结合蛋白的功能[24]。

3　circRNA的研究方法

对circRNA 的研究主要包括circRNA 的鉴定、circRNA 的表达和生物学功能研究。circRNA 的鉴定依赖于多种检测工具，目前已有的circRNA 检测工具和算法包括MapSplice[25]、PredcircRNA[26]、UROBORUS[27]、NCLscan[28]、circRNA_finder、find_circ、CIRC explorer和CircSeq等[20,29]。上述工具对circRNA 检测的精确度和灵敏度各不相同，联合使用可有效预测circRNA。

目前已有大量的circRNAs 被检测出来，并建立多个circRNA 数据库，包括circBase (http://www.circbase.org/)[30]、circRNABase (http://starbase.sysu.edu.cn/mir-CircRNA.php)[31]、Circ2Traits (http://gyanxet- beta.com/circdb)[32]、circ-Net (http://circnet.mbc.nctu.edu.tw/)[33]、deepBasev2.0 (http://deepbase.sysu.edu.cn/)[34]、Circ Interactome (http://circinteractome.nia.nih.gov/)[35]等。上述数据库收录了已发表的circRNA 数据，并对新的circRNAs及circRNA 与miRNA的潜在结合位点和相互作用关系进行预测，构建circRNA 表达图谱和miRNA-circRNA、circRNA-RNA结合蛋白(RBP)互作网络，为开展circRNA的功能研究提供有用的工具。

circRNA 表达及生物学功能研究利用常规生物学技术，如实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)、载体构建、蛋白印记(Western blot)、免疫组化(Immunohistochemistry staining)、RNA 印迹(Northern blot)等结合生物信息学软件，分析circRNA 在不同组织中的表达差异，预测circRNA 与miRNA 的潜在结合位点，探究circRNA 在疾病或某些生理过程中的作用机制，为更深入了解circRNA的功能提供技术支持。

4　circRNA在畜禽中的研究进展

目前，有关circRNA的研究主要集中于疾病(尤其是癌症)方面[36-42]，关于动物尤其是畜禽的相关研究报道相对较少。在家畜方面，Ven等[43]研究发现circRNA在胚胎期猪的脑发育过程中具有重要的调控作用。Zhang等[44]研究产后90 和250 d的奶牛乳腺组织中差异表达的circRNA，结果发现来源于酪蛋白的差异circRNA在奶牛乳腺组织中高表达，提示其可能参与酪蛋白的表达调控。Sun等[45]研究蓝塘猪和长白猪肌肉组织中差异表达的编码基因、LncRNA、circRNA及miRNA，结果发现差异表达的circRNA其236个来源基因中有93个是与肌肉发育相关的主要功能基因。Tao等[46]研究发现麻城黑山羊和布尔山羊排卵前的卵泡组织中共有37个差异表达的circRNA，其中chi_circ_0008219可与3个卵泡相关的miRNA相结合，提示circRNA对母羊卵巢卵泡有潜在的影响。Li等[47]研究产前和产后绵羊脑垂体中差异表达的circRNA，结果表明大量的circRNA与垂体特异性的miRNA相互作用并参与脑垂体的生物学功能。Wei等[48]分析胚胎期和成年牛的背最长肌中差异表达的circRNA，结果发现过表达circLMO7抑制初生牛的成肌细胞分化，其通过竞争性结合miR-378a-3p发挥作用。Li等[49]利用RNA-seq方法研究胚胎期和生产后绵羊背最长肌组织中的circRNA，分析结果发现差异表达的circRNA其来源基因主要富集于肌肉生长和发育相关的信号通路。而在家禽方面，关于circRNA的相关研究报道仅见Zhang等[50]发现circRNA的改变参与鸡禽白血病J亚型引起的肿瘤形成过程，其他方面的研究还未见报道。

5　展 望

目前对于circRNA 的研究尚处起步阶段，有大量问题需要被进一步阐明。随着高通量测序技术和生物信息学的快速发展，越来越多的circRNA被鉴定，circRNA的功能研究越来越深入。近年来研究发现circRNA与疫病发生密切相关，可以作为未来癌症等疾病检测的新型标志物[51-52]。在畜禽方面，近年来对circRNA的研究主要集中在与经济性状相关的circRNA的研究上。鉴于circRNA在基因表达调控中的重要作用，深入开展与畜禽经济性状(包括肌肉发育、肉质、繁殖、脂肪沉积等)相关的circRNA的鉴定与功能研究，为更好地了解和开展畜禽分子育种提供理论依据和技术指导。

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