非索非那定体内探针药物法考察脑心通胶囊对大鼠P-gp活性的影响*

欧阳慧子，刘华明，王兴蕊，常艳旭，何 俊

脑心通胶囊由黄芪、赤芍、丹参、当归、川芎等16味中药组成，具有益气活血、化瘀通络等作用，临床上常与西药联合使用用于中风、脑梗死、冠心病和心绞痛等疾病的治疗[1-2]，并取得了较好的疗效。脑心通胶囊所含化学成分众多[3]，与其他药物联合使用时易产生药物间的相互作用。P糖蛋白（P-gp）为细胞膜上的磷糖蛋白，广泛存在于人体的各组织器官中。作为体内组织的一种外排转运蛋白，P-gp对药物的吸收、分布、代谢以及排泄过程均会产生较大的影响，是许多药物之间产生相互作用的重要影响因素[2]。

目前，在对药物影响P-gp活性的评价研究中，探针底物法是一种广泛使用的方法。相关研究已证实，非索非那定的吸收与肠黏膜上P-gp密切相关[3]，P-gp介导的肠道分泌可以降低其口服吸收，选择非索非那定作为P-gp的体内探针药物，检测其在体内的药物浓度，可有效的反应药物对体内P-gp活性的影响[6-8]。脑心通胶囊所含化学成分众多，其所含化学成分如丹参酮ⅡA、川芎嗪等可对P-gp活性产生影响[9-11]，联合用药时可能会通过影响P-gp的活性而引发药物间的相互作用。因此，本研究采用非索非那定探针药物法考察脑心通胶囊对P-gp活性的影响，为脑心通胶囊临床联合安全用药提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 6430型三重四级杆质谱仪，配备电喷雾离子源（美国Agilent公司）；Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Agilent MassHunter分析软件（美国Agilent公司）；AX 205型十万分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q超纯水制备仪（Millipore公司）；3 K 15型高速离心机（美国Sigma公司）；XW-80 A型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂）。

1.2 试剂与药物 非索非那定（购自中国食品药品检定研究院，批号为100852-201202，含量为99.8%）；苯海拉明（购自中国食品药品检定研究院，批号为100066-200807，含量为99.9%）；脑心通胶囊（购自陕西步长制药有限公司）；乙腈、甲醇均为色谱纯，购自Merk公司；甲酸为色谱纯，购自ROE公司；超纯水为Milli-Q制备。

1.3 动物 健康雄性Sprague-Dawley大鼠，SPF级，体质量（230±10）g，购自天津市山川红实验动物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Waters XBridgeTMC18柱（2.1 mm×100 mm,3.5μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱，洗脱程序为 0～3 min，25%～90%A；3～6 min，90%～25%A；流速 0.4 mL/min；柱温30℃；进样量5μL。

2.2 质谱条件 电喷雾离子源，多反应正离子模式监测；毛细管温度为350℃；干燥气流速9 L/min；雾化器压力10 psi。非索非那定的定量离子对为m/z502.3→466.3，碎裂电压120 V，碰撞能量25 V；内标苯海拉明的定量离子对为m/z 256.1→166.9，碎裂电压70 V，碰撞能量5 V。

2.3 对照品溶液的制备 精密称定非索非那定对照品5 mg，用甲醇溶解，配制为1 mg/mL的非索非那定对照品储备溶液。另取内标苯海拉明对照品1 mg，用甲醇稀释为250 ng/mL的内标溶液，4℃冰箱储存备用。

2.4 非索非那定及脑心通供试品溶液的制备 精密称取非索非那定对照品适量，以20%的甘油溶液溶解，配制成浓度为1.256 mg/mL的非索非那定溶液，置4℃冰箱中储存备用。精密称取脑心通药品粉末适量，采用0.5%CMC-Na溶液配制成浓度为50 mg/mL的脑心通供试品溶液，置4℃冰箱中储存备用。

2.5 血浆样品处理方法 精密量取血浆样品100μL，依次加入25μL内标溶液（苯海拉明250 ng/mL），25μL空白甲醇，涡旋混匀，加入400μL乙腈，涡旋3 min，14 000 r/min离心 5 min，取上清 500μL氮气吹干，100μL甲醇复溶，涡旋 3 min，14 000 r/min离心10 min，取上清进样分析。

2.6 方法学考察

2.6.1 专属性考察 精密量取100μL空白血浆，除不加内标外，其他按“2.5”项下处理并进样测定，得MRM图谱A；将一定量的非索非那定对照品溶液及内标溶液加入空白血中，同法处理，得MRM图谱B；取大鼠灌胃后的血浆样品依同法处理，得MRM图谱C。非索非那定的保留时间为4.47 min，内标苯海拉明的保留时间为3.80 min，血浆样品中内源性物质不干扰非索非那定和内标的测定，结果如图1所示。

2.6.2 标准曲线及线性范围 取大鼠空白血浆配制成含非索非那定浓度分别为 1、2、10、25、50、100、250 ng/mL的血浆样品，按照“2.5”项下方法处理，取上清进样分析并记录，以非索非那定与内标的峰面积的比值Y为纵坐标，血浆样品中非索非那定的浓度X为横坐标，线性加权回归，权重系数为1/x2，求得非索非那定的回归方程为Y=0.505 082X+0.005 755，r=0.998 1，以 S/N=10为最低定量限，则非索非那定的最低定量限为1 ng/mL。

2.6.3 精密度与准确度 精密量取大鼠空白血浆及一定量的非索非那定对照品溶液，配制成含非索非那定浓度分别为2、25、250 ng/mL的低、中、高3个浓度的质控样品（QC）各6份，按“2.5”项下方法处理，连续测定3 d，计算方法的日内、日间精密度。得非索非那定低、中、高3个浓度QC样品日内、日间精密度RSD值分别小于8.7%和7.1%，准确度在93.9%～109.1%之间。

图1 非索非那定(2)和内标(1)的MRM图Fig.1 Representative MRM chromatogramsof IS(1)and fexofenadine(2)

2.6.4 回收率及基质效应 取非索非那定浓度为2、25、250 ng/mL的低、中、高3个浓度的QC样品各6份，按“2.5”项下操作处理，取上清，进样 5μL，记录峰面积为A1；另取空白血浆100μL，除不加内标外，按“2.5”项下操作至乙腈萃取上清液氮气吹干，所得空白基质残渣分别用相应低、中、高浓度混合对照品溶液复溶，进样测定，记录峰面积为A2，则回收率为R=A1/A2×100%；同样条件下，进样相应浓度低、中、高浓度对照品溶液，记录各化合物峰面积为A0；则基质效应M=A2/A0×100%。3个浓度QC样品的回收率分别为（83.0±7.3）%，（86.8±3.7）%，（87.2±1.0）%；内标苯海拉明的回收率为（66.4±2.6）%。3个浓度QC样品的基质效应分别为（86.2±4.2）%，（92.1±2.9）%，（90.0±1.0）%。内标苯海拉明的基质效应为（90.4±2.1）%。

2.6.5 稳定性实验 制备低、中、高3个浓度（2、25、250 ng/mL）的 QC 品各 3份，按“2.5”项下操作，分别考察样品在室温下放置4 h、反复冻融3次再处理、处理后放置自动进样器24 h以及血浆样品放置-70℃冰箱7 d的稳定性。非索非那定准确度均在88.2%～108.1%之间，RSD值在1.4%～7.4%之间。结果表明样品在上述条件下非索非那定稳定性良好。

2.7 药代动力学研究 雄性SD大鼠18只，给药前禁食24 h，自由饮水。非索非那定和脑心通胶囊分别采用20%的甘油和0.5%CMC-Na混悬溶液溶解，给药剂量按照临床给药剂量折算，非索非那定的实际给药剂量为12.56 mg/kg，脑心通胶囊的给药剂量为500 mg/kg。实验分3组，分别为非索非那定单次给药组（A组），非索非那定和脑心通联合单次给药组（B组），脑心通给药7 d，第8天灌胃给予非索非那定和脑心通组（C组），分别于给药前及给药后 0.03、0.08、0.17、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h经大鼠眼底静脉丛取血，置于肝素化塑料管中，7 000 r/min离心10 min，-70℃冰箱储存，直到进样分析。

3种给药方式下非索非那定平均血药浓度时间曲线见图2。采用DAS1.0软件计算3组大鼠口服非索非那定的药动学参数，结果见表1。实验数据采用SPSSStatistics统计软件处理，采用单因素方差分析比较各组间的药动学参数差异，组间两两比较采用Dunnett检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果与讨论

实验采用苯海拉明作为内标，其保留时间较待测物非索非那定的保留时间较早，且不影响待测物的测定。有文献报道，非索非那定血浆处理方法包括有机溶剂提取法和固相萃取法等。有机溶剂提取操作步骤较为繁琐，固相萃取法成本较高[12]。本实验采用乙腈沉淀蛋白的方法对血浆样品进行预处理，非索非那定的提取回收率为83.0%～87.2%，内标为66.4%左右，满足生物样品测定条件。

表1 不同组大鼠口服非索非那定的药动学参数Tab.1 Pharmacokinetic parameters of fexofenadine in different groups

图2 给药后非索非那定的平均血药浓度时间曲线Fig.2 Mean plasma concentration-time curvesof fexofenadine in ratsafter oral administration

文章以非索非那定为探针底物，建立快速评价大鼠体内P-gp活性的LC-MS/MS检测方法，并用于考察脑心通胶囊对大鼠体内P-gp活性的影响。结果表明，脑心通胶囊单次给药对非索非那定药动学的影响未呈现统计学意义，但经连续8 d灌胃给药脑心通胶囊后，非索非那定的 AU C（0－tn）、AUC(0-∞)显著性升高，提示大鼠经连续灌胃给药脑心通胶囊后，可能对大鼠体内P-gp的活性产生了抑制作用，并导致P-gp对非索非那定的外排作用减弱。以上药动学参数的差异可能与脑心通胶囊中丹参、川芎等药材所含化学成分有关，长期灌胃给予脑心通胶囊后会影响大鼠体内P-gp活性的表达。

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