马铃薯皮中黄酮类物质的提取及其抑菌活性研究

王慧芳， 邵圣娟， 辛先荣， 王 曼， 姚 英， 陈志敏， 卫静莉

(太原工业学院 化学与化工系， 山西 太原 030008)

黄酮类化合物是一类存在于自然界中具有2-苯基色原酮(flavone)结构的化合物， 其羟基衍生物多为黄色， 故又称黄碱素或黄酮. 黄酮具有非常广泛的药用功效， 如提高免疫力[1]、 抗氧化[2]、 抗菌[3]、 消炎[4]、 抗癌[5]、 护肝[6]、 降血脂[7]、 治疗脑血栓[8]等， 研究前景十分广阔. 马铃薯是我国北方一种重要的经济作物， 其含有丰富的淀粉、 蛋白质、 膳食纤维以及维生素、 矿物质等， 其性甘平具有养护脾胃、 益气润肠、 预防高血压、 抗癌等功效[9-12]. 马铃薯味道清淡， 烹饪方法多样， 深受北方消费者的喜爱， 被人们誉为“地下苹果”和“第二面包”， 在不久的将来， 以马铃薯为原料的主食必将成为我国重要的食品产业之一[13]. 研究表明[14-18]， 马铃薯皮中含有较为丰富的抗氧化物质， 如多酚、 黄酮、 花青素等， 其中主要的抗氧化物质为黄酮类化合物. 目前， 针对马铃薯的研究主要集中在其营养价值、 有效成分的提取、 黄酮类化合物含量的测定及其抗氧化性的测定等方面[19-23]， 而对其黄酮类物质的抑菌活性， 尤其是马铃薯皮中黄酮抑菌活性的研究则鲜见报道.

本研究采用超声波提取法， 通过单因素和正交试验相结合的方法对马铃薯皮粉中黄酮类物质的提取工艺进行探索， 确定最佳提取工艺条件， 并测试其对5种革兰氏菌的抑菌活性， 为探寻新的天然食品防腐剂提供理论依据.

1 实验部分

1.1 材料、 菌种与药品

马铃薯块茎购于山西太原迎新街菜市场.

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)， 大肠杆菌(E.enteritidis)， 枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)， 鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)， 普通变形杆菌(Proteusvulgaris)；

培养基： 称取蛋白胨5 g， 牛肉膏3 g， NaCl 3 g， 琼脂条18 g， 去离子水1 L， 于121 ℃下灭菌30 min， 冷却， 备用；

芦丁标准对照品： 上海融禾医药科技发展有限公司； 茶多酚(98%)： 郑州裕和食品添加剂有限公司； 牛肉膏、 蛋白胨、 琼脂条、 无水乙醇、 九水硝酸铝、 亚硝酸钠、 氢氧化钠均为国产分析纯.

1.2 仪器与设备

YM96-II型超声波细胞粉碎机(上海豫明公司)； TU-1901紫外可见分光光度计(北京普析公司)； RE 52A型旋转蒸发仪(上海亚荣公司).

1.3 提取实验流程

马铃薯块茎→清洗→刮皮(厚2 mm)→切块→烘干(60 ℃， 2 h)→粉碎→过筛(60目)， 取10 g粉末用乙醇超声提取， 趁热抽滤. 将滤液置于旋转蒸发仪中浓缩至糊状后， 储藏备用.

1.4 单因素试验

分别考察超声功率、 乙醇体积浓度、 料液质量比、 提取时间4个因素对马铃薯皮粉中总黄酮提取率的影响， 得出适宜的超声提取条件范围.

1.5 正交试验

依据1.4单因素实验结果， 采用L9(34)正交试验， 优化马铃薯皮粉中总黄酮的提取工艺， 并进行重复性实验， 最终确定马铃薯皮粉中总黄酮的最佳提取条件.

1.6 马铃薯皮粉中总黄酮含量的测定

1.6.1 标准曲线的绘制

准确移取0.2 mg/mL的芦丁标准液0， 0.5， 1， 1.5， 2， 2.5， 3， 3.5 mL， 分别置于8个10 mL容量瓶中， 各加入0.30 mL 5%(质量浓度)的NaNO2溶液， 摇匀， 放置6 min， 再加0.30 mL 10%(质量浓度)的Al(NO3)3溶液， 摇匀， 放置6 min 后再加4 mL 10%(质量分数)的NaOH溶液， 摇匀， 最后用50%(体积分数)的乙醇定容. 放置15 min 后， 在513 nm处测其吸光度值， 其中空白参照为0号试剂. 所得标准曲线如图 1 所示， 回归方程为：y=5.003 2x+0.031 8，R2=0.999.

图 1 芦丁标准曲线图Fig.1 Standard curve of Rutin

1.6.2 样品中总黄酮提取率的测定

分别称取不同条件下的马铃薯皮粉提取液0.1 g 于10 mL的容量瓶中， 用体积浓度为50%的乙醇定容， 稀释后按标准溶液的显色方法处理， 放置15 min后， 在513 nm处测定其吸光度， 依据标准曲线得出马铃薯皮粉提取液中总黄酮的质量浓度， 并按式(1)计算其提取率. 由于提取液(棕黄色)在513 nm处有吸收， 故测定时需减去该部分吸收， 加标回收检验[24]， 计算回收率， 回收率一般在96.0%～98.4%.

1.7 马铃薯皮粉提取液中黄酮的抑菌活性

1.7.1 溶液的配制

菌悬液的配制： 将5种活化后的细菌分别用适量无菌水稀释， 得到菌悬液， 其浓度为108CFU/mL， 备用；

茶多酚抑菌液的配制： 称取0.51 g茶多酚(98%)， 用体积浓度为70%的乙醇配制成质量浓度为50 mg/mL的茶多酚液， 备用；

马铃薯皮黄酮抑菌液的配制： 称取一定量的马铃薯皮粉提取物， 用同样的方法配制成质量浓度为50 mg/mL的黄酮样液， 备用.

1.7.2 抑菌活性测定

采用文献[25]的方法， 将100 μL菌悬液用移液枪注入到已灭菌的琼脂培养基上， 在无菌条件下用棉棒涂布均匀， 再用打孔器(6 mm)在其中央打两个对称的孔， 在两孔中分别注入体积浓度为70%的乙醇和抑菌液各100 μL， 将其放在培养箱(30 ℃)中培养2 d后观察其生长情况. 其中， 阳性对照为茶多酚， 空白阴性对照为无菌水. 每组设4个平行实验， 用游标卡尺十字交叉量取其抑菌圈的直径(mm)， 取其平均值.

实际抑菌圈直径=所测抑菌圈直径-6.0.

2 结果与分析

2.1 超声功率的筛选

以体积浓度70%的乙醇溶液为提取剂， 料液质量比1∶15， 提取3 min， 选择的超声功率分别为200, 300, 400, 500, 600, 700 W， 结果见图 2.

图 2 超声功率对黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic wave on the extraction yield of flavonoids

由图 2 可以看出， 超声波促使马铃薯皮的细胞壁破坏， 其中的黄酮类物质不断被溶出， 随着超声波功率的逐渐增大， 提取率也随之增大， 到500 W时达到最大值2.67%. 当超声功率超过500 W 时， 随着空化作用的增强， 黄酮的分子结构也被破坏[26-28]， 从而导致提取率下降. 故超声功率选择在400～500 W之间.

2.2 乙醇体积浓度的筛选

在超声功率500 W， 料液质量比1∶15， 提取3 min的条件下， 乙醇的体积浓度分别为50%, 60%, 70%, 80%, 90%， 结果如图 3 所示.

由图 3 可知， 随着乙醇体积浓度的增加， 对马铃薯皮细胞的渗透性逐渐增强， 黄酮提取率也逐渐升高. 当其体积浓度达到80%时总黄酮提取率达到最大值2.75%. 当乙醇的体积浓度再增大时， 马铃薯皮粉中的醇溶性杂质以及色素等的溶出量也随之增加， 导致总黄酮的提取率降低， 故乙醇的体积浓度选择在80%～90%之间.

图 3 乙醇体积浓度对黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of flavonoids

2.3 料液质量比的筛选

在超声功率500 W， 乙醇的体积浓度70%， 提取3 min的条件下， 料液质量比分别为1∶10, 1∶15, 1∶20, 1∶25, 1∶30， 结果如表 1 所示.

表 1 料液质量比对黄酮提取率的影响

由表 1 可知， 随着溶剂质量的增大， 马铃薯皮中的黄酮类化合物从植物组织中的溶出越来越充分. 当质量比为1∶20时其中的黄酮被全部溶出， 提取率达到最高值2.92%. 当再增加溶剂量时， 马铃薯皮中的醇溶性杂质溶出增大， 黄酮提取率降低. 溶剂量太大也会增加后期处理的成本， 因此料液质量比选择在1∶25～1∶15.

2.4 超声时间的筛选

在超声功率500 W， 乙醇的体积浓度70%， 料液质量比1∶20的条件下， 提取时间分别为1, 2, 3, 4, 5 min， 结果如图 4 所示.

由图 4 可知， 当超声提取时间在1～3 min时， 由于超声波空化作用时间的增加， 马铃薯皮粉中的黄酮类物质逐渐被溶出， 提取率提高显著， 且在超声3 min时达到最大值2.92%， 然后趋缓， 说明此时马铃薯皮粉中的黄酮类物质已全部溶出， 因此， 超声提取时间选择在2～4 min.

图 4 超声时间对黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of flavonoids

2.5 正交实验

在上述单因素实验的基础上， 为进一步优化马铃薯皮粉中黄酮类化合物的提取工艺， 设计了L9(34)正交试验， 结果见表 2.

表 2 正交实验与极差分析

由表 2 可知， 影响马铃薯皮粉中总黄酮提取率的顺序是乙醇体积浓度>超声时间>超声功率>料液质量比， 其中乙醇体积浓度的影响最为显著， 料液质量比则为次要因素. 最优提取工艺条件为当超声功率为400 W， 乙醇的体积浓度为80%， 料液质量比为1∶25， 提取4 min， 此时， 马铃薯皮粉中总黄酮提取率最高， 为2.92%.

2.6 抑菌实验

按1.7.2的方法， 以天然抑菌剂茶多酚为参照对象， 测试马铃薯皮中的黄酮类化合物对五种革兰氏菌的抑菌活性， 结果见表 3.

由表 3 可知， 马铃薯皮中的黄酮和茶多酚均对被测菌种有显著的抑菌活性， 尤其是对金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌， 其抑菌活性与茶多酚相当. 可见， 超声波并没有影响马铃薯皮中黄酮的抑菌活性. 马铃薯皮中黄酮对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌)的抑菌活性优于阴性菌(大肠杆菌、 鼠伤寒沙门氏菌、 普通变形杆菌)， 对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最佳， 而对大肠杆菌和普通变形杆菌的抑菌性则相对较弱.

表 3 马铃薯皮中黄酮类物质与茶多酚对供试菌种的抑菌活性比较

3 结 论

最优的工艺条件下， 马铃薯皮粉中总黄酮提取率为2.92%， 比王利珍[24]研究所用的大孔树脂提取法(最高提取率2.24%)提高了0.68%. 可见， 超声波法提取马铃薯皮黄酮更有优势. 另外， 本研究所用的提取剂为廉价易得的乙醇(体积浓度80%)， 相比较张薇[23]研究所用的体积分数80%丙酮而言， 安全性更高， 且超声提取时间仅为4 min， 较前者的 2 h和3 h缩短了许多， 从而大大减少了能耗.

抑菌活性结果表明： 马铃薯皮黄酮对金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌、 枯草芽胞杆菌、 鼠伤寒沙门氏菌以及普通变形杆菌均有较好的抑制效果. 其中， 对金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌活性最优， 抑菌圈直径分别为(22.02±1.05) mm和 (21.73±2.01) mm， 与茶多酚的(21.43±1.53) mm 和(22.93±1.03) mm相当， 若与其复配将有望得到更加优良的天然食品防腐剂. 马铃薯皮中黄酮对普通变形杆菌的抑菌活性最低， 抑菌圈直径仅为(11.07±1.97) mm. 在同等条件下， 马铃薯皮黄酮对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别为(20.54±1.38) mm， (17.64±1.98) mm， 而顾采琴等[25]研究的纯化前香蕉皮黄酮的抑菌圈直径分别为(20.35±1.98) mm， (18.52±1.73) mm， 可见， 马铃薯皮黄酮对枯草芽孢杆菌的抑菌活性与香蕉皮中黄酮相当， 而对大肠杆菌的活性则相对偏弱. 综上所述， 马铃薯皮中的黄酮同样对细菌的生长具有良好的抑制作用， 虽然其抑菌活性大多低于茶多酚， 但仍不失为一种良好的天然抑菌剂. 马铃薯资源丰富， 若将其皮中黄酮类化合物的抑菌活性充分利用起来， 不但可以实现节能环保， 更为马铃薯皮的综合利用开辟新路.

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