青霉素作用机制的研究进展及其假说

韦朝华 俞黎黎 霍江华 钱炳俊

摘 要：青霉素是临床使用范围较广，效果好且经济的一种抗生素。基于青霉素的作用位点，人们认为青霉素对革兰阳性菌的效果较好，但同时临床试验发现对革兰阴性球菌同样有较好的效果，但对革兰阴性杆菌的抗菌效果较差，那么它的杀菌机理到底如何？本文就目前对青霉素作用机制的研究现状做出分析和探讨。

关键词：青霉素 作用机制 研究进展

中图分类号：R74 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2018）07（a）-0230-04

自从英国科学家Fleming1929年发现青霉素并用于临床后[1]。青霉素此后一直在细菌感染疾病方面的治疗有较好的临床效果和广泛的临床应用，它的研制使得人类进入了抗生素时代，开创了用抗生素治疗疾病的新纪元。因为细菌细胞壁是它的特殊作用位点，使得青霉素如今仍然居于不可替代的地位。青霉素作为β-内酰胺类抗生素的一员，能抑制细胞壁的合成。在低渗环境下，细菌会自发吸入外界的水分，发生膨胀，而细胞壁就好像是高压锅的“锁”，防止细菌炸裂。一旦细胞壁发生缺陷，就好像是高压锅突然失去了安全保护，细菌自然就会发生涨裂，从而死亡。然而人体组织与培养基不一样。研究人员发现，在组织中，细菌往往处于一个等渗的状态。换句话说，即便它们的细胞壁被破坏了，这些细菌也不大会发生裂解。有意思的是，青霉素等β-内酰胺类抗生素并没有对此束手无策。相反，这些抗生素能用其他手段防止细菌增长，并让它们死亡。研究人员认为，这或许和氧化带来的损伤，或是细胞壁前体通路循环受阻有关。当前，对青霉素作用机制及细菌的耐药机制研究日益丰富，新的细菌耐药机制及新的抗生素作用机制的发现，是指导临床和非临床抗生素合理应用以及发现新型抗生素的基础[2-3]。但β-内酰胺类抗生素的作用机制是一个多步骤而复杂的问题，对其杀菌机制仍是目前研究热点。

基于青霉素的作用位点认为青霉素对革兰阳性菌的效果较好，但同时临床试验发现对革兰阴性球菌同样有较好的效果，但对革兰阴性杆菌的抗菌效果较差，那么它的杀菌机理到底如何？本文就目前对青霉素作用机制的研究现状做出分析和探讨。

1 目前研究近况与分析

近年来对青霉素作用机制的研究工作广泛深入的开展，基于研究的成果，目前分为三个时期。

1.1 基于青霉素临床效果的研究

自发现青霉素以来，人们对其作用机制研究的第一阶段的主要成果归结于药敏实验和临床应用的观察，有3个重要的早期研究结果[4]：⑴发现青霉素对革兰阳性菌的作用效果要优于革兰阴性菌；⑵发现青霉素对正在增殖的细菌杀菌效果较好而对静止期的细菌无效，说明其杀菌机制应为在细菌增殖时对其发生干扰；⑶发现青霉素能够诱导细胞形态的改变，目前解释为干扰了细胞壁的代谢破坏了其完整性所致[5]。比格认为青霉素杀死了处于分裂期的球 菌，而对不分裂的个体则没有影响。于是，比格提出间歇性地加入青霉素，希望这些“顽固者”能在加药间歇期开始分裂从而被下一剂青霉素杀死。研究发现在低浓度的青霉素中，球菌膨胀到正常体积的三倍而不分裂，杆菌也表现出类似的变化。托德在关于青霉素溶菌作用实验的报道中也引用了这一研究和其他研究结果。在用I型、II型和III型肺炎双球菌、绿色链球菌、溶血链球菌、葡萄球菌和韦氏梭菌进行的研究中，他发现所用的这些菌株都被青霉素溶解了，然而像大肠杆菌和绿脓杆菌等对青霉素具有抗性的细菌则不被溶解。但是他认为青霉素不通过溶菌作用也能杀死细菌。当溶菌发生时，其速率取决于细菌增殖的实际速率或潜在速率。“看来抑菌、杀菌和溶菌可能是同一过程中依次进行的不同阶段。”最快的溶菌速度出现在增殖速率最大的细菌中。这也许就是青霉素如此有效的真正原因，也就是说，培养时间不长的增殖活跃的细菌更易受到溶菌作用影响，虽然这时细菌最容易侵入人体，但是同时也最容易被溶解。

1.2 基于细菌的形态学研究

第二阶段的主要研究成果是随着对细菌细胞壁组成成分的了解而取得的。革兰阳性细胞壁由肽聚糖和胞壁酸构成，革兰阴性菌细胞壁由肽聚糖和外膜构成。革兰阳性菌的肽聚糖由聚糖支架、四肽侧链和五肽交联桥三部分组成，革兰阴性菌肽聚糖由聚糖支架和四肽側链两部分组成。聚糖支架由N-乙酰葡萄糖胺（N-acetyl glucosamine）和N-乙酰胞壁酸（N-acetylmuramic acid）交替间隔排列，以β-1，4糖苷键连接而成；每个胞壁酸分子上连接一条四肽侧链，革兰阳性菌四肽侧链通过五肽交联桥相互连接，构成坚韧的三维立体框架结构。与革兰阳性细菌不同的是，革兰阴性菌的四肽侧链与相邻四肽侧链直接连接，缺少五肽交连桥，形成较疏松的二维网状结构。

1965年Strominger等[6]在这阶段做出了重要贡献，提出D-丙氨酰-D-丙氨酸立体构型酷似青霉素（见图1），青霉素的作用机制可能是抑制了黏肽交联过程中转肽反应，转肽酶因而误认青霉素为其底物，因为青霉素分子与乙酰-D-Ala-Ala的分子结构类似，竞争性地与酶的活性中心结合，当酶和青霉素通过酰化反应被不可逆地交联在一起时（见图2），酶即失活，致使细菌细胞壁合成中的交联反应中断，从而阻止细胞壁肽聚糖交联的形成，细菌由于细胞壁的破坏而死亡[7]。所以在早期研究青霉素作用中，发现当金黄色葡萄球菌在节基青霉素存在下培养，其细胞壁含有的D-丙氨酸比正常情况下多，这可能就是转肽酶与青霉素结合引起的结果[8]。

青霉素能自由通过革兰阳性菌的细胞壁，而青霉素只有通过革兰阴性菌的细胞壁一是通过直接在膜的类脂相扩散，二是外膜上的膜孔道蛋白进入，是进入革兰阴性菌的主要途径。青霉素作为治疗革兰阴性球菌尤其是奈瑟菌属的首选药，作用在交联反应中竞争性结合相邻的氨基上，从而使细菌细胞壁合成障碍继而死亡，但究其细胞壁结构，革兰阴性菌没有五肽交联桥，不参与肽聚糖的交联反应，那么青霉素对革兰阴性球菌如淋病奈瑟菌的作用机制是如何呢，是否其作用不仅仅是与转肽酶结合还有可能在四肽侧链丙氨酸的合成上，而且实验证明青霉素对大肠埃希菌的作用效果不好。但与此同时也会产生其他猜想-青霉素对革兰阴性球菌仍然有较好的效果，是不是球菌与杆菌的形态学差异导致其不同耐药性的不同，所以理解它们的细胞壁的合成过程是至关重要的。这种认识不仅在细胞形成和分裂的环境中很重要，而且在目前抗生素耐药性的大环境中也很重要，因为细胞壁合成是β-内酰胺类抗生素的靶标，对细菌形态形成的有价值的认识表明，对形态学上不同的生物体进行比较研究，包括临床相关的病原体，以更好理解细菌的生长与分裂，而这些需进一步研究验证[9]。

細菌的形状是由细胞壁决定的，并且可以是非常多样化的。即使是在球菌的属中，也有不同的形状存在。例如，葡萄球菌或奈瑟菌细胞是真正的圆型，链球菌，乳酸球菌，或肠球菌都有卵形。有趣的是，有机体的形状与它的一组青霉素结合蛋白之间似乎存在着某种联系，这种酶是细胞壁的主要组成部分——肽聚糖。虽然只有一个肽聚糖生物合成机械似乎存在于葡萄球菌中，但其中两种机械被提议在卵形细菌中发挥作用，从而加强了不同种类的球菌的形态发生的内在差异。

1.3 基于靶向分子学的研究

基于细菌细胞壁可以选择性透过青霉素的基础上，青霉素作用机制研究的第三阶段，其主要研究结果是阐明了青霉素的作用位点是青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs），研究表明细菌的细胞膜上有特殊的蛋白分子，能与青霉素或头孢菌素类相结合，称为“青霉素结合蛋白（PBP）”。1972年，Suginaka[10]等通过放射性同位素标记青霉素的方法检测到细菌表面的PBP，它具有糖基转移酶、肽基转移酶和羧肽酶活性。青霉素的β-内酰胺环与细菌D-丙氨酰-D-丙氨酸末端具有相似的结构，能与 D-丙氨酰-D-丙氨酸竞争 PBPs的活性位点。并且，相比于 D-丙氨酰-D-丙氨酸，β-内酰胺环与PBPs的亲和性更高。β-内酰胺类抗生素通过β-内酰胺环中的羧基和细菌相应 PBPs 结合，从而有效控制生物学功能，致使网状细胞壁无法形成，还可引起细菌形态改变，导致细菌细胞死亡，以此发挥杀菌作用（见图3）[11]。

研究发现青霉素与不同细菌青霉素结合蛋白结合引起了细菌形态学改变。一种是与PBP2特异性结合的β-内酰胺类抗生素，能够使细菌的形态变成卵形；第二种是与PBP3优先结合的β-内酰胺类抗生素，能够特异性地抑制细菌细胞的分裂；第三种是与PBP1优先结合的β-内酰胺类抗生素，抑制细胞的延生并引起细胞的裂解。在没有PBP1的细菌中，青霉素与PBP2和PBP3结合后，能够看到细菌细胞会出现“鼓胀”现象。例如：对革兰阴性的脑膜炎双球菌，青霉素主要与其膜上PBP1与PBP2结合后，引起细菌形态的变化，形成丝状体和球形体，中隔膨胀等，最后导致细菌生长停止，通过细菌直溶酶使细菌溶解死亡。淋病奈瑟菌可用青霉素治疗也是同样的道理。但是青霉素并不是对所有的革兰阴性菌都有作用，例如一些革兰阴性杆菌布鲁菌属、假单胞菌属、大肠埃希菌属等对其均耐药，可能由于这些菌缺少PBP[12]。与此同时，发现革兰阴性菌的外膜对不易透过青霉素，从而引发猜想是否与其通透方式或通透性有关。在细菌中，PBPs的数量有很大的不同，而rod型的大肠杆菌有12个，而球菌的数量则更少，通常从4个到7个PBPs。这些数字最初是由在凝胶电泳前用放射性标记的青霉素培养的细胞或膜来确定的。所以说PBPS的不一样很有可能是最终原因。

2 结语

不过，在经历了青霉素洗礼、已经奄奄一息的细菌进一步遇到溶菌酶时，居然会发生意想不到的改变——在溶菌酶的作用下，这些细菌索性脱去了细胞壁，摇身一变，进入了一种叫做“L-form”的形态。纽卡斯尔大学的这支团队对L-form形态的细菌有过报道。此类细菌没有细胞壁，因此青霉素或溶菌酶等通过破坏细胞壁来杀菌的方法对其不起作用。而有着此类形态的细菌在人体组织的保护下，还能够正常生长。研究人员们指出，这也是许多感染复发的潜在原因之一。基础理论的研究，能推动科学以更快的速度向前发展，β-内酰胺类抗生素抗菌作用机理的研究，正是在广泛推行这类抗生素的结构改造迫切需要理论指导的历史背景下开展起来的，尽管β-内酰胺类抗生素的结构改造已经取得了重要的成就，但这些成就是在惊人庞大的工作规模下取得的，因为缺少正确的理论指导，在化合物设计中很难避免大量存在的盲目性。所以，当Strominger等在1965年提出β-内酰胺类药物的作用机制后，不仅很快吸引了更多的人，从各个方面投入这个基础理论研究，而且使世界β-内酰胺类抗生素的结构改造，出现了逐渐转向围绕这个作用机制进行设计研究的趋势。就本文对一些问题的思考，希望对未来青霉素作用机制的研究提供思路，为开发更有效的抗菌药物提供参考。

参考文献

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