蛇足石杉组培快繁体系的研究

王锋+武芸

摘要：通过对蛇足石杉（Huperzia serrata）的组织培养进行系统研究，建立蛇足石杉的快速繁殖体系。结果表明，100 mg/L AAS+0.5 mg/L孔雀石绿组合对蛇足石杉外植体内生菌的抑制效果较好，外植体存活率为20%。蛇足石杉初代培养的最佳培养基为MS+蔗糖20 g/L+琼脂4.59 g/L+IBA 0.05 μg/L+KT 1.4 μmol/L+谷氨酰胺0.1 g/L+山农一号0.05%+TDZ 0.3 mg/L，诱导率达80%；继代培养中愈伤组织诱导在MS+1.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D的条件下，愈伤组织诱导率可达70%；诱导生根的最佳培养基为 1/3MS+1.5 mg/L IBA+2.0 mg/L谷氨酰胺，生根率可達90%。

关键词：蛇足石杉（Huperzia serrata）；组织培养；快速繁殖；愈伤组织

中图分类号：S791.27；S722.37 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）24-4888-04

蛇足石杉（Huperzia serrata）为石杉科石杉属蕨类植物[1-6]，由于富含石杉碱甲，能增强记忆、抗老年性痴呆等[7-11]。为了获取石杉碱甲而无节制地采挖，加上其生长极其缓慢，致使蛇足石杉资源快速减少，因此开展蛇足石杉快速繁殖技术研究很有必要的。由于其植株中内生真菌丰富，蛇足石杉组培技术虽有学者进行了探索[12]，但效果不佳，重复性差，用组织培养的方法探索蛇足石杉最佳培养条件仍然是亟待解决的问题。本研究建立蛇足石杉组培快繁体系，为解决药用蕨类植物蛇足石杉原料缺失瓶颈提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：蛇足石杉采自湖北省中药材研究所的药材基地（恩施市长岭岗）。

试剂：MS基本培养基、0.1%升汞、无水乙醇、TDZ、2，4-D、谷氨酰胺、蔗糖、蒸馏水、孔雀石绿、琼脂、IBA、KT、山农一号、AAS（30 mg/L青霉素、50 mg/L链霉素和125 μg/L两性霉素配制而成）。

1.2 试验方法

1.2.1 愈伤组织的诱导 选取蛇足石杉的嫩茎尖、茎段、叶片，将蛇足石杉的茎段切成1～2 cm的小段，清洗干净并流水冲洗24 h。在超净工作台上用75%乙醇消毒30 s，无菌水冲洗1次，滤纸吸干水；再用0.1%升汞对茎段、茎尖、叶片分别消毒杀菌6.0、3.5、3.5 min，用无菌水清洗5次，最后在0.05%山农一号溶液中浸泡9 min，接种于添加不同植物生长调节剂的MS培养基中，在25 ℃，光照度2 000 lx、12 h/d的条件下培养10 d。按以下公式计算诱导率：诱导率=形成愈伤组织的外植体块数/接种外植体的块数×100%。

1.2.2 外植体内生菌的防治 将外植体表面消毒并培养10 d未被染菌的茎尖移入到MS培养基中，MS培养基中添加孔雀石绿（0、0.1、0.5、1.0 mg/L）和AAS（0、50、100、500 mg/L）的组合浓度进行内生菌灭菌，共有16个处理组，每个处理20瓶，每瓶接种1个外植体。在25 ℃，光照度2 000 lx、12 h/d的条件下培养20 d。

1.2.3 继代培养 用初代培养存活下来的蛇足石杉茎尖外植体在MS培养基作为基本培养基，添加蔗糖20 g/L+琼脂4.59 g/L+谷氨酰胺0.3 g+碳粉2 g/L+赤霉素0.5 mg/L。以TDZ（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L）和2，4-D（1.0、2.0、3.0 mg/L）的组合浓度在MS培养基中，选出适合蛇足石杉腋芽诱导的培养基，共15个处理组，每个组接种20瓶，每瓶接种2个外植体。在温度25 ℃，光照度2 000 lx、12 h/d的条件下培养30 d后观察结果。

1.2.4 蛇足石杉生根培养基的改善 选用茎尖外植体作为材料处理，选择MS、1/2MS、1/3MS、1/4MS作为基本的生根培养基，并组合不同浓度的IBA（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L）组合，共20个组合，每个组合接种10瓶，每瓶接种1株，30 d后统计生根率。在基本培养基中添加20 g/L蔗糖和0.1 mg/L谷氨酰胺。

2 结果与分析

2.1 不同植物生长调节剂对蛇足石杉愈伤组织的诱导效应

本试验从单因子到两两组合使用IBA、KT、TDZ、谷氨酰胺4种植物生长调节剂添加在MS培养基上，观察诱导效果。

2.1.1 IBA的诱导效应 由表1可知，IBA对蛇足石杉愈伤组织的诱导效果显著，在浓度为0.05 μg/L时诱导率最高，其愈伤组织成黄绿色、疏松状，生长势较好。

2.1.2 KT的诱导效应 由表2可知，KT对蛇足石杉的愈伤组织的诱导效果不明显，且为深黄绿色、疏松的愈伤组织，长势也比较差。当浓度为1.4 mg/L时，其诱导率最高，但都出现了一定程度的染菌，在当褐化中KT的浓度越高时其褐化就越严重，生长势也越差。

2.1.3 TDZ的诱导效应 由表3可知，TDZ对蛇足石杉愈伤组织的诱导效应。TDZ浓度为0.3 mg/L时，其诱导率最高，其愈伤组织的为淡绿色、疏松状，其长势比KT的生长要好一些。

2.1.4 2，4-D的诱导效应 2，4-D对蛇足石杉的愈伤组织的诱导效果见表4，为淡绿色、疏松的愈伤组织。其中当2，4-D浓度为1 mg/L其诱导效果相对较好，但仍然有不同程度的染菌，染菌颜色呈纯白色菌色，2，4-D的浓度越高时其褐化程度就越严重。

2.1.5 TDZ与IBA组合对蛇足石杉愈伤组织的诱导效应 由表5可知，TDZ 0.3 mg/L+IBA 0.05 μg/L组合对蛇足石杉愈伤组织的诱导较好，其生长势也相对较好的，愈伤组织成绿色、疏松、膨大组织，但还是有不同程度的染菌。endprint

由表6显示，TDZ 0.3 mg/L+IBA 0.05 μg/L+KT 1.4 μmol/L+谷氨酰胺0.1 g/L对蛇足石杉的诱导率可以达到80%，比TDZ 0.3 mg/L+IBA 0.05 μg/L组合的诱导率要高。但染菌程度比较严重的，多种植物生长调节剂组合的培养基诱导出现的玻璃化程度较高。

2.2 不同外植体对蛇足石杉愈伤组织的诱导效应

由表7可知，不同外植体在愈伤组织诱导中诱导效率不一样，从高到底依次是茎尖、叶片、茎段。诱导率分别是茎尖75%、叶片65%、茎段45%。茎尖诱导的愈伤组织碧绿、膨大、疏松，而叶片和茎段的愈伤组织的诱导效果不很明显，生长势也不好，染菌也比较严重，所以最适合的外植体部位为茎尖。

2.3 不同孔雀石綠和AAS组合对内生菌的防治效果

研究结果（表8）显示，当孔雀石绿浓度达到1.0 mg/L时，不论AAS浓度为多少时外植体没有被感染都是全部死亡，浓度为1.0 mg/L的孔雀石绿致使外植体全部死亡。在没有孔雀石绿的情况下，AAS浓度为100 mg/L和150 mg/L时，其具有一定的灭菌能力，但是灭菌效果差，染菌的外植体数太多。在没有AAS下孔雀石浓度在0.5 mg/L时也具有一定的杀菌力度，但是染菌数目还是较大。当AAS和孔雀石绿一定浓度组合共同杀菌比其中单独一种杀菌效果要好，当AAS浓度为50 mg/L和孔雀石绿为0.5 mg/L组合、100 mg/L AAS和0.5 mg/L孔雀石绿组合共同杀菌，外植体存活率都为20%，但是在50 mg/L AAS和0.5 mg/L孔雀石绿灭菌条件下还是具有真菌，只是真菌的生长速度有所减慢。因此，在蛇足石杉外植体内生菌杀灭中使用100 mg/L AAS和0.5 mg/L孔雀石绿组合消毒杀菌效果较好，经这种方式消毒杀菌后将外植体置于黑暗条件下2 d后再放置弱光下培养效果更好。

2.4 蛇足石杉试管苗的继代培养试验结果

结果表明（表9），在TDZ为2.5 mg/L时，愈伤组织萌发数为0，诱导率也为0，可以得出在TDZ为2.5 mg/L时，因浓度过高导致不能够让愈伤组织萌发。TDZ浓度不变的条件下，随着2，4-D的浓度升高愈伤组织萌发数减少，诱导率也不断下降，因此2，4-D为1 mg/L处时诱导率最高；2，4-D浓度不变时，愈伤组织萌发数和诱导率会随着TDZ浓度升高先升高后降低。所有处理中诱导率最高为70%，即在1.0 mg/L TDZ和1 mg/L 2，4-D组合的条件下最适合蛇足石杉愈伤组织的萌发。

2.5 蛇足石杉生根培养基的选择结果

由表10可知，7、10、11、12号处理的生根率比较高，分别达到70%、70%、80%、70%，尤其是11号的生根率最高，达到了80%。在IBA浓度不变的条件下，1/3MS培养基都比较适合幼苗的生根。当培养基不变的条件下，生根率先随着IBA的浓度升高而升高，在到达IBA浓度为1.5 mg/L时生根率达到最大，随后随着IBA浓度的增加生根率反而下降。在培养基为1/3MS培养基上培养，IBA浓度为1.5 mg/L是生根率最好，然后用11号的组合加上2.0 mg/L谷氨酰胺会使生根率达到90%。因此，蛇足石杉幼苗生根的最佳培养基为1/3MS培养基并加上1.5 mg/L IBA和2.0 mg/L谷氨酰胺。

3 结论

研究结果表明，蛇足石杉外植体内生菌的抑制较好组合为100 mg/L AAS+0.5 mg/L孔雀石绿；在初代培养，继代培养和生根培养的研究中均取得了一定的进展，蔗糖20 g/L+琼脂4.59 g/L+IBA 0.05 μg/L+KT 1.4 μmol/L+谷氨酰胺0.1 g/L+0.05%山农一号+TDZ 0.3 mg/L作为初代培养的培养基效果较好；继代培养的MS培养基中添加1.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D效果较好；诱导生根的培养基为1/3MS中添加1.5 mg/L IBA和2.0 mg/L谷氨酰胺效果较好。

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