基于Image J软件的肌原纤维蛋白SDS—PAGE优化

朱萌+石柳+汪兰+熊光权+吴文锦+李新+丁安子

摘要：采用浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%的SDS-PAGE凝胶系统，运用Image J软件分析不同蛋白质浓度、pH、NaCl浓度对肌原纤维蛋白的分离效果。结果表明，在蛋白质浓度为1.2 mg/mL、pH为7.5、NaCl浓度为0.5 mol/L时，肌原纤维蛋白中各蛋白质及其亚基实现较好分离，均匀分布于整个电泳条带，且各蛋白条带光密度值能清晰分辨。Image J软件能有效地应用于SDS-PAGE图像分析。

关键词：肌原纤维蛋白；SDS-PAGE；Image J软件

中图分类号：TS254.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）24-4839-05

Image J软件是由National Institutes of Health开发的基于Java的图像处理软件，可计算选定区域内分析对象的一系列几何特征。现已广泛应用于植物叶片形态特征描述[1]、金属显微定量分析[2]、针织物孔隙率统计[3]、淀粉表面几何特征分析[4]等场景。目前，Image J软件在电泳图像分析中也有应用，可将蛋白条带数据进行量化，转化为光密度值，解决了肉眼观察的不确定性问题[5]。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）作为一种快速、经济、可重复的蛋白质定性、定量分析及特征鉴定的方法，已广泛应用于各种畜禽肉[6]、水产品[7]、水稻[8]、大豆[9]等农产品蛋白质的分析检测。采用条件适宜的缓冲溶液稀释提取的样品蛋白，并制备电泳样品，利用SDS-PAGE中网状结构聚丙烯酰胺凝胶所具有的分子筛效应，将不同分子量的蛋白质及其亚基进行分离，从而达到分辨蛋白质的目的。但对于一些极端条件下的样品蛋白，如高NaCl浓度的酱油发酵液、蛋白酶解液等，不能直接运用SDS-PAGE手段进行分析检测。因此，本试验对肌原纤维蛋白在不同溶液环境（蛋白质浓度、pH和NaCl浓度）条件下进行SDS-PAGE，采用Image J软件对电泳图像进行数据量化，综合光密度值指标，得到适宜的溶液环境条件范围，为极端条件下的SDS-PAGE的样品准备提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1 500 g左右的新鲜健康草鱼（Ctenopharyngodon idellus），购于湖北省武汉市武商量贩农科城店。30 min内低温运送到实验室用于提取肌原纤维蛋白。

磷酸、盐酸、氯化钠、十二烷基硫酸钠、甲醛、冰乙酸、氯化镁、考马斯亮蓝R-250、G-250，国药集团化学试剂有限公司；过硫酸铵、30%丙烯酰胺Acr-Bis、蛋白上样液、电泳缓冲液、1.5 mol/L Tirs-HCl，武汉科瑞生物技术有限公司；Pre-stained Protein Marker，天根生化科技有限公司（11-245 kDa）；EGTA，美國Biosharp公司；Tris-BASE、0.5M Tris-HCl，美国Dow Chemical公司；四甲基乙二胺（TEMED），美国MYM公司。

1.2 仪器与设备

F050A片冰机，福建雪人股份有限公司；GL-21M离心机、HI650R离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司；722N可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；PB-10 Sartorius pH计，德国Sartorius公司；T18高速均质机，德国IKA公司；DYY-12型电泳仪电源、24DN制胶器、电泳槽、WD-9406型胶片观察灯，北京市六一仪器厂；Universal Hood Ⅱ凝胶拍照系统，美国Bio-Rad公司；SHA-C恒温振荡器，常州国华电器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 提取肌原纤维蛋白 参照Wu等[10]的方法，取新鲜草鱼背部肌肉45 g，切碎，加入4倍体积的分离缓冲溶液（0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L H3PO4，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，pH 7.0）高速匀浆30 s后，低温离心（2 000 g，15 min，4 ℃），重复操作2次；取沉淀再用4倍体积0.1 mol/L NaCl溶液高速匀浆30 s，低温离心（2 000 g，15 min，4 ℃），重复操作1次，得到的沉淀即为肌原纤维蛋白，保存于 4 ℃冰箱，48 h内可用。蛋白质浓度采用考马斯亮蓝法[11]测定。

1.3.2 制备电泳样品 不同蛋白质浓度：采用Tris-HCl缓冲液（0.5 mol/L NaCl，pH 7.5）对肌原纤维蛋白进行稀释，获得终浓度为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mg/mL的蛋白质溶液。

不同pH：采用20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（含0.5 mol/L NaCl）调节肌原纤维蛋白浓度至1.2 mg/mL，然后采用1 mol/L NaOH、1 mol/L HCl调节pH为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的蛋白质溶液。

不同NaCl浓度：采用20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）对肌原纤维蛋白进行稀释，获得终浓度为1.2 mg/mL，NaCl浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L的蛋白质溶液。

分别取100 μL上述蛋白质溶液置于1.5 mL的离心管，加50 μL上样液，混匀并在沸水中加热3 min，冷却至室温，即为制备的SDS-PAGE样品。将样品储存于-20 ℃冰箱，一周内进行试验。

1.3.3 电泳条件 制胶：参考Laemmli[12]的方法，采用5%的浓缩胶、12%的分离胶进行制胶。

上样：蛋白样品上样量为10 μL，Marker上样量为5 μL。

电泳：将适量电泳缓冲液加入电泳槽中，直至没过凝胶。连接电源，设定起始电压80 V，电流50 mA；待样品从浓缩胶进入分离胶后，电压调整至120 V；待凝胶中蓝色指示线完成消失，电泳结束。endprint

染色及脱色：将玻璃板上凝胶剥离，在染色液（50%甲醇+10%冰乙酸+0.1%考马斯亮蓝R-250+40%水）中振荡浸泡2 h，然后转至脱色液（50%甲醇+10%冰乙酸+40%水）中脱色30 min，再用去离子水浸泡凝胶，并每2 h更换1次去离子水，直至凝胶中电泳条带清晰。

照相：采用Universal Hood Ⅱ凝胶拍照系统进行拍照，光源选择白光，无滤光片，其余设置为自动。

1.4 凝胶电泳图的Image J软件分析

参考张美硕[13]和陈炜烨等[5]的方法，采用Image J软件对肌原纤维蛋白SDS-PAGE图进行量化分析。

2 结果与分析

2.1 分离胶浓度的影响

1.2 mg/mL肌原纤维蛋白溶液（20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH 7.0）在不同分离胶浓度（10%、12%、15%）下的电泳图如图1所示。参考Shi等[14]和Araki等[15]的相关研究，对电泳条带所属蛋白质亚基进行标注。当分离胶浓度为10%时，标准蛋白（Marker）中分子量为11～25 kDa的蛋白条带未显示，样品中肌球蛋白轻链2亚基和3亚基（MLC-2、MLC-3）条带缺失（图1a）；与此相反，分离胶浓度为15%时，尽管所有条带均可见，但样品中大分子量的肌联蛋白（Co）、肌球蛋白重链二聚体（MHC-2）、肌球蛋白重链（MHC）条带分布过于紧凑，小分子蛋白条带模糊（图1c）。12%的分离胶浓度条件下，肌原纤维蛋白分子量范围为11～245 kDa的所有条带清晰可见，且分散均匀（图1b）。

研究表明，丙烯酰胺聚合物的有效孔径随着分离胶浓度的增加而减小[16]。当分离胶浓度为7.5%时，平均孔径约为50？魡，当分离胶浓度增大至30%时，丙烯酰胺聚合物的平均孔径则减小到20？魡[17]。本试验中，当分离胶浓度为10%时，SDS-PAGE凝胶中孔径较大，在电场作用下肌原纤维蛋白分子量较小的MLC-2（18 kDa）、MLC-3（16 kDa）亚基和部分Marker条带（11、17、20 kDa）可能因无法被截留而穿透凝胶。当分离胶浓度为15%时，SDS-PAGE凝胶中孔径较小，虽然实现了MLC-2和MLC-3的分离，但是分子量较大的Co、MHC-2和MHC因迁移率最慢，被截留聚集在凝胶顶部，未得到有效分离。当分离胶浓度为12%时，肌原纤维蛋白中各蛋白质及其亚基均实现较好分离，且均匀分布于整个电泳条带。因此，后续试验中选用12%的分离胶浓度。

2.2 肌原纤维蛋白浓度的影响

不同肌原纤维蛋白浓度的SDS-PAGE如图2所示。随着蛋白质浓度的增加，MHC、AC等条带逐渐变宽，颜色也逐渐加深。当蛋白质浓度为0.3～0.6 mg/mL时，MHC、AC、TM、MLC-1、MLC-3清晰可见，但是TNT、TNI、MLC-2较为模糊，50～100 kDa范围的蛋白質没有显现。当蛋白质浓度为0.9 mg/mL时，50～100 kDa范围的蛋白质条带仍不明显。当蛋白质浓度为1.2～1.8 mg/mL时，各蛋白条带均清晰可见。

采用Image J软件对SDS-PAGE电泳图进行分析，各蛋白条带光密度值见表2。结果表明，检测到17组蛋白条带，随着蛋白质浓度的增加，各蛋白条带光密度值也逐渐增大。当蛋白质浓度为0.3～0.9 mg/mL时，只检测到12组，在50～100 kDa范围内的蛋白条带与凝胶基色差异不明显，未被软件识别。当蛋白质浓度为1.2～1.8 mg/mL时，肌原纤维蛋白中各蛋白条带光密度值均能清晰识别。但随着蛋白质浓度的进一步增加，肌原纤维蛋白中主要蛋白如MHC、AC等条带光密度值变化不明显。因此，蛋白质浓度为1.2～1.8 mg/mL时均能得到较好试验结果，但从实际操作角度考虑，最佳蛋白质浓度为1.2 mg/mL。

2.3 pH的影响

不同pH条件下的肌原纤维蛋白SDS-PAGE如图3所示。结果表明，缓冲溶液pH对肌原纤维蛋白SDS-PAGE影响不明显。pH在5.0～8.0范围内变化时，肌原纤维蛋白中各蛋白及其亚基条带分布均匀、清晰可见。

Image J软件分析结果见表3。共检测到17组蛋白条带，与蛋白质浓度的Image J检测结果一致。随着缓冲溶液pH的变化，肌原纤维蛋白中主要蛋白如MHC、AC等条带光密度值呈先下降后上升趋势，在pH为6.5和7.0时最小，在pH为7.5时最大。因此，缓冲溶液pH在5.0～8.0范围内均能得到较好试验结果，缓冲溶液pH为7.5时最佳。

2.4 NaCl浓度的影响

不同NaCl浓度条件下的肌原纤维蛋白SDS-PAGE如图4所示。当NaCl浓度为0时，肌原纤维蛋白条带整体色浅不易见，且有部分蛋白条带缺失，如TNT。当NaCl浓度为1.0～2.5 mol/L时，随着NaCl浓度的增加，肌原纤维蛋白中主要蛋白MHC、AC、TM等条带逐渐变窄，颜色变浅；大分子量的Co、MHC-2等条带逐渐丢失；小分子量的TM、TNT、TNI、MLC-1、MLC-2、MLC-3条带变化不大。只有当离子强度为0.5 mol/L时，肌原纤维蛋白中各蛋白质及其亚基均清晰可见，效果最优。

Image J软件分析结果见表4。当NaCl浓度为0时，肌原纤维蛋白中主要蛋白MHC、AC、TM等条带光密度值远低于NaCl浓度为0.5 mol/L时。这是因为肌原纤维蛋白为盐溶蛋白，在NaCl浓度为0时，蛋白质溶解度较低，只有少部分蛋白被溶解，使得制备的电泳样品中蛋白质浓度低于1.2 mg/mL。当NaCl浓度由0.5 mol/L增加至1.0 mol/L时，肌原纤维蛋白中肌球蛋白亚基（MHC、MLC-1、MLC-2、MLC-3）、肌钙蛋白亚基（TNT、TNI）、AC、TM条带的光密度值均有不同程度增大，表明这些蛋白在NaCl浓度为1.0 mol/L时具有较高的溶解性；大分子量的MHC-2亚基和180 kDa的未知蛋白电泳条带的光密度值明显减小，Co条带消失不见；分子量在35～180 kDa时，蛋白条带的光密度值维持不变。当NaCl浓度大于1.0 mol/L时，随NaCl浓度的增加，肌原纤维蛋白质所有蛋白及其亚基的光密度值均明显减小，甚至消失。因此，NaCl浓度为0.5 mol/L时，所有蛋白条带都能得到最优显示。endprint

3 結论

肌原纤维蛋白中复杂的蛋白质包含多种蛋白质，分子质量在16～480 kDa。分离胶浓度会影响蛋白的迁移率，浓度为12%时肌原纤维蛋白中各蛋白质及其亚基实现较好分离。

综合肉眼观察和Image J软件分析，确定了肌原纤维蛋白的SDS-PAGE最佳环境条件为蛋白质浓度1.2 mg/mL、pH 7.5、NaCl浓度0.5 mol/L。对于高NaCl浓度的酱油发酵液、蛋白酶解液等极端样品，在制备电泳样品时需进行脱盐、稀释等处理，以降低NaCl浓度。Image J将肌原纤维蛋白中各蛋白及其亚基条带转化为光密度值，解决了肉眼观察的不确定性，提高了准确性，能有效地应用于SDS-PAGE图像分析。

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