甲苯咪唑对黄河鲤过氧化氢酶活性的影响

2018-01-27郭国军弓飞龙唐国盘徐文彦秦改晓齐子鑫

湖北农业科学 2017年24期

郭国军+弓飞龙+唐国盘+徐文彦+秦改晓+齐子鑫

摘要：为探讨甲苯咪唑对鲤鱼的致毒机理，采用静态水质接触染毒法，研究在不同暴露浓度（0、0.1、0.2、0.4、0.6 mg/L甲苯咪唑）和不同暴露时间（24、72、120、168 h）下甲苯咪唑对黄河鲤（Cyprinus carpio L. var. haematopterus Temminck et Schlegel）鳃、肝胰脏和肾脏里过氧化氢酶活性的影响。结果显示，甲苯咪唑对鲤鱼过氧化氢酶活性具有明显的诱导作用，呈现一定的剂量效应与时间效应，且随浓度的升高和时间的延长，过氧化氢酶活性呈先升高、后降低的变化趋势，特别是在暴露于甲苯咪唑72 h后，各处理浓度对黄河鲤鳃、肝胰脏和肾脏里过氧化氢酶活性的影响均达极显著水平。甲苯咪唑引起黄河鲤中毒的主要靶分子可能是过氧化氢酶，过氧化氢酶活性可作为鲤鱼甲苯咪唑中毒的指示指标。

关键词：黄河鲤（Cyprinus carpio L. var. haematopterus Temminck et Schlegel）；甲苯咪唑；过氧化氢酶活性；鳃；肝胰脏；肾脏

中图分类号：S965.116：S859.79+5：Q554+.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）24-4830-03

黄河鲤（Cyprinus carpio L.var.haematopterus Temminck et Schlegel）是河南省一个重要的水产养殖对象，是河南省渔业产业的支柱之一。近年来，随着黄河鲤养殖规模持续扩大，养殖密度不断提高和养殖环境日益恶化，养殖病害的频繁发生给养殖产业带来了严重的经济下滑。为了降低病害对黄河鲤养殖造成的损失，甲苯咪唑往往被用于治疗黄河鲤的指环虫、三代虫等单殖吸虫类寄生虫病。然而，甲苯咪唑的过量使用也会对养殖水体造成污染，从而对黄河鲤产生毒害作用。目前有关甲苯咪唑对鱼类的毒理作用报道很少，而且主要集中在半致死浓度、体内药物代谢及残留消除的研究上[1-5]，尤其是对黄河鲤的研究甚少。过氧化氢酶（Catalase，CAT）是动物、植物以及微生物机体防御体系的关键酶之一，机体的内外环境变化可引起细胞代谢产生过氧化氢，过氧化氢是强氧化剂，对细胞有一定的毒害作用，过氧化氢酶的存在可以及时清除细胞产生的过氧化氢，保护细胞免受过氧化物的毒害而应对环境变化。试验通过测定经不同浓度甲苯咪唑浸泡的黄河鲤鳃组织、肝胰脏、肾脏中的CAT活性，探索了黄河鲤抗氧化防御体系对甲苯咪唑引起毒性效应的应答特性，以期了解黄河鲤对甲苯咪唑的抗毒机理，为黄河鲤集约化养殖生产和水质的评价、检测提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试动物

试验使用的黄河鲤来源于郑州市渔场，其体重为40.4 g±1.86 g，体長12 cm±2 cm。先将经曝气处理后的自来水注入水族箱中，随后把黄河鲤置于水族箱中养殖，试验期间不投食。水质条件如下：pH 6.8～7.4，溶氧6～10 mg/L，水温13～15 ℃，总硬度为715（德国硬度），其他指标符合文献[6]的要求。

1.2 仪器与试剂

仪器主要有752紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、Anke TDL-5-A台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、FA1604N电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；玻璃匀浆器、1 cm石英比色皿、秒表、注射器（5 mL）以及解剖工具（各种类型镊子、剪子和不锈钢手术刀）。试剂主要有甲苯咪唑（广东利建制药有限公司）；甲酸（上海试剂一厂）； CAT试剂盒（南京建成生物科技有限公司）。

1.3 试验设计与采样

根据课题组已经发表的甲苯咪唑对黄河鲤鱼急性毒性试验结果[1]，设定1个空白对照组和4个染毒处理组，甲苯咪唑液的制备是将0.10 g甲苯咪唑溶于1 mL甲酸，然后用去离子水稀释至试验所用甲苯咪唑浓度，分别为0.10、0.20、0.40、0.60 mg/L，每组3个水族箱，每箱放黄河鲤15尾，试验采用水质接触染毒法，试验期间不更换试液。

在含有不同浓度甲苯咪唑稀释液水体的水族箱中，黄河鲤分别浸泡24、72、120、168 h后，从每箱中随机选取3尾，迅速解剖，剪取鳃、肝胰脏和肾，用预冷的去离子水冲洗干净，滤纸吸干后装袋密封，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.4 样品处理

各组织样品在4 ℃下解冻，迅速剪碎，按1∶9加入预冷生理盐水（0.67%），玻璃匀浆管中匀浆5 min，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取上清液，再用生理盐水稀释成1%的组织匀浆液。

1.5 CAT活性测定

样品的组织蛋白和CAT 活性的测定均采用南京建成生物科技有限公司试剂盒测定。CAT活性定义为：每毫克组织蛋白酶分解1 μmol H2O2的量为1个酶活性单位。

1.6 数据处理

试验所得数据采用Microsoft Office Excel 2010程序处理，并用其制图；运用SPSS 19.0统计软件进行数据统计分析，描述性统计值采用平均值±标准差（x±SD）表示，以0.05为统计检验水平，通过单因素方差分析进行组间差异的显著性检验。

2 结果与分析

2.1 甲苯咪唑对黄河鲤鳃组织CAT活性的影响

甲苯咪唑对黄河鲤鳃组织CAT活性的影响情况见图1。由图1可知，各染毒处理组的鳃组织CAT活性都高于对照组，并且随着甲苯咪唑浓度的升高，鳃组织CAT活性呈现出先增大后减少的变化趋势，当浓度为0.20 mg/L时达到最大。用这个浓度处理24、72、120、168 h后，与对照组相比，鳃组织CAT活性分别提高了5.18%、5.54%、4.19%、3.81%，其中72 h后大大高于对照组，24、120 h后明显高于对照组，而168 h后与对照组相比，鳃组织CAT活性无明显变化。随着染毒时间延长，各处理组鳃组织CAT活性也呈现出先增大后减少的变化趋势，且染毒时间为72 h时达到最大。与对照组相比，4个染毒处理组在72 h时鳃组织CAT活性分别提高了4.73%、4.53%、4.53%、2.10%，其中0.10、0.20 mg/L染毒处理组大大高于对照组，0.40 mg/L染毒处理组明显高于对照组，而0.60 mg/L染毒处理组与对照组相比，鳃组织CAT活性无明显变化。endprint

2.2 甲苯咪唑对黄河鲤肝胰脏CAT活性的影响

甲苯咪唑对黄河鲤肝胰脏CAT活性的影响情况见图2。由图2可知，暴露于不同浓度甲苯咪唑水体中的黄河鲤肝胰脏CAT活性变化规律与鳃组织CAT活性变化规律相似，CAT活性也是呈现出先增大后减少的变化趋势，其中24 h后0.20 mg/L染毒处理组和72 h后各染毒浓度处理组CAT活性与对照组相比，均大大提高，分别提高了4.21%、6.53%、6.60%、6.88%、5.68%；24 h后0.10、0.40 mg/L染毒处理组和120 h后0.20 mg/L染毒处理组CAT活性与对照组相比，均明显提高，分别提高了3.49%、5.26%、3.36%，而其他各染毒处理黄河鲤肝胰脏CAT活性与对照组相比均无明显变化。

2.3 甲苯咪唑对黄河鲤肾脏CAT活性的影响

甲苯咪唑对黄河鲤肾脏CAT活性的影响情况见图3，由图3可知，暴露于不同浓度甲苯咪唑水体中的黄河鲤肾脏CAT活性变化规律与肝胰脏CAT活性变化规律相似，CAT活性也是呈现出先增大后减少的变化趋势，与对照组相比，24 h后0.20、0.40、0.60 mg/L染毒处理组和72 h后各染毒处理组黄河鲤肾脏CAT活性均大大提高，分别提高了6.78%、7.42%、6.78%、7.81%、8.66%、8.87%、7.95%，24 h后0.10 mg/L和120 h后0.20 mg/L染毒处理组黄河鲤肾脏CAT活性呈明显提高，分别提高了5.58%、4.28%，而其他各染毒处理黄河鲤肾脏CAT活性与对照组相比均无明显变化。

3 小结与讨论

鱼类对水体中的毒物較为敏感，鳃组织是鱼体吸收毒物的主要部位，肝胰脏和肾脏是鱼体吸收毒物后的主要解毒和排毒器官，因此通过研究毒物接触后鱼鳃、肝胰脏、肾脏中酶活性的变化，可以指示水体的毒物污染程度，并可预测毒物对水生生态系统的影响。CAT是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶，其功能是催化细胞内的过氧化氢分解，防止膜脂过氧化的发生，其中最主要的就是参与活性氧代谢过程。在环境胁迫等逆境情况下，生物体内广泛存在活性氧爆发现象，导致自由基增多，使细胞膜产生过氧化，细胞膜被破坏和损伤。在活性氧代谢过程中，CAT可以使H2O2发生歧化生成水和氧分子，与SOD、POD共同组成了生物体内活性氧防御系统，在清除超氧自由基、H202和过氧化物以及阻止或减少羟基自由基形成等方面发挥着重要的作用[7]。贾秀英等[8]、成嘉等[9]分别研究了水中镉离子和铅离子等重金属对水生动物组织CAT活性的影响，徐境波等[10]、陈家长等[11]、罗朝军等[12]、黎东怡等[13]分别研究了硝基芳烃、除草剂阿特拉津、农药三唑磷、重铬酸钾等有机化合物对不同鱼类组织CAT活性的影响，结果表明，随重金属离子、有机物浓度、接触时间的不同，CAT活性呈现一定的剂量效应与时间效应，对不同水生动物CAT活性表现出明显的诱导作用，且随时间延长和浓度的升高呈先升高、后降低的变化趋势。本试验同样表明甲苯咪唑对黄河鲤CAT活性具有明显的诱导作用，呈现出一定的剂量效应与时间效应，且随浓度的升高和时间延长，CAT活性呈先升高、后降低的变化趋势，特别是在染毒甲苯咪唑72 h后，各染毒处理浓度对黄河鲤的鳃、肝胰脏和肾脏CAT活性影响均达到较高水平，表明甲苯咪唑在一定的浓度范围内，对黄河鲤具有一定的生理调节机能；黄河鲤CAT活性对有毒物质胁迫的敏感性，可以作为水生生态系统中有毒物质的生物监测指标。

试验结果表明，处理组随染毒时间延长，黄河鲤3种组织器官中CAT活性呈现先升高后降低的变化趋势，这表明在一定浓度范围内，短时间内甲苯咪唑对黄河鲤组织中CAT活性有一定的诱导作用，这可能是黄河鲤中毒的先兆；但随着染毒时间的延长，CAT活性又出现一定程度的降低，可能是甲苯咪唑的毒性作用在加强，因此，CAT活性可作为甲苯咪唑中毒指示指标；同时也表明甲苯咪唑引起黄河鲤中毒的主要靶分子可能就是CAT。

参考文献：

[1] 徐文彦，郭国军，齐子鑫，等.阿维菌素和甲苯咪唑对黄河鲤的急性毒性研究[J].淡水渔业，2011，41（2）：88-91.

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[3] 郭东方，刘永涛，艾晓辉，等.甲苯咪唑在银鲫体内的药代动力学研究[J].中国水产科学，2009，16（3）：434-441.

[4] 胥宁，刘永涛，艾晓辉，等.甲苯咪唑在团头鲂体内主要代谢物及其变化规律研究[J].淡水渔业，2013，43（6）：39-44.

[5] 潘浩，王荻，卢彤岩.甲苯咪唑在鲫体内的药动力学[J].水产学杂志，2016，29（4）：38-42.

[6] GB11607-89，渔业水质标准[S].

[7] 刘冰，梁婵娟.生物过氧化氢酶研究进展[J].中国农学通报，2005，21（5）：223-225.

[8] 贾秀英，董爱华，施农农.镉对鲫鱼组织过氧化氢酶活性的影响[J].上海环境科学，2000，19（8）：394-395.

[9] 成嘉，符贵红.重金属铅对鲫鱼乳酸脱氢酶和过氧化氢酶活性的影响[J].生命科学研究，2006，10（4）：372-376.

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[11] 陈家长，孟顺龙，胡庚东，等.低浓度阿特拉津对鲫鱼过氧化氢酶（CAT）活性的影响[J].农业环境科学学报，2008，27（3）：1151-1156.