应用蚕豆微核技术监测渭河宝鸡段水质污染状况

李爱玲+贾盼

摘要：采用蚕豆根尖细胞微核技术，对渭河宝鸡段的上、中、下游水样进行检测。结果表明，渭河宝鸡段上、中、下游水样的微核率平均分别为1.23‰、1.65‰和1.74‰；污染指数分别为1.84（轻度污染）、2.46（中度污染）和2.60（中度污染）。随着水污染程度的加重，过氧化氢（H2O2）和丙二醛（MDA）呈升高趋势。

关键词：蚕豆；渭河；微核率；污染指数

中图分类号：X522；X132 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）24-4727-04

宝鸡市依托渭河而立，是中原通往西南、西北的交通枢纽，陕、甘、川、宁四省（区）毗邻地区的商贸和物流中心，是西部大开发承东启西的重要支点。

目前，对水体监测有多种方法，而微核试验是根据被打断的DNA分子或由纺锤丝断裂造成整条染色体落后于核分裂形成微核的现象来检测某些理化因素造成遗传损伤的一种简便、快速的遗传毒理学研究方法。微核试验具有敏感度高、快速经济、不需要精尖技术等优点，在环境监测中应用较为广泛[1-3]。蚕豆根尖微核试验是世界范围内推广运用的环境致突变性检测技术，20世纪80年代初，世界卫生组织（WHO）、联合国环境署（UNEP）和美国国家环保局（USEPA）相继确定了蚕豆根尖微核试验在环境化学物致突变性检测中的作用，并建议在全世界范围内推广[4-6]，1986年，被中国环保局列为水环境生物测试的规范方法，用于检测水体的致突变性[7]。

随着城市人口的增加、工农业的快速发展，渭河水质污染问题已引起社会各界的广泛关注。对渭河水质污染状况的研究，通常利用常规物理化学手段进行监测，而有关生物学技术监测污染情况的研究鲜有报道。本研究采取渭河宝鸡段上、中、下游水样分别对蚕豆进行处理，通过测定蚕豆根尖细胞的微核率、污染程度和过氧化氢（H2O2）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的变化，并结合各采样点河段污水排放情况，综合评价了渭河宝鸡段的水质污染状况，为有效开展水体污染监测、农田灌溉等水污染引起健康危害的预防提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 西安市售优质青皮蚕豆；环磷酰胺，上海第十二制药厂；H2O2测定试剂盒（比色法）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）测定试剂盒（羟胺法）、MDA测定试剂盒（TBA法）和SOD测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；改良苯酚品红染色液，北京雷根生物技术有限公司。其他常用试剂为分析纯或生化试剂。

1.1.2 仪器 数码显微摄影系统（Leica DM750），徕卡公司和联想（北京）有限公司；数显恒温水浴锅，上海跃进医疗器械有限公司；台式离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；721型分光光度计，上海棱光技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水样采集 渭河宝鸡段主要接纳工业废水和居民生活废水，周围有居民聚集区、工业厂房等建筑，附近还有山脉、森林等自然环境。2015年9月，依据渭河水质状况及两岸污染源，分别取渭河宝鸡段上、中、下游水样，每样点采集水样1 000 mL，于4 ℃冰箱避光保存，用于蚕豆根尖细胞微核检测。同时观察记录水质表观特征及两岸污染源情况。

1.2.2 微核试验 选取无虫害、无霉变的饱满蚕豆，试验操作步骤和方法见参考文献[8，9]，分别用渭河宝鸡段上、中、下游水样培养蚕豆根尖作为试验组；阴性对照为自来水培养的蚕豆根尖；阳性对照为 2 mg/L环磷酰胺培养的蚕豆根尖。

1.2.3 微核率统计 玻片的编号与计数采用盲法。计数时，选取涂片及染色质量好的区域，避开过分重叠和细胞破坏的区域。微核直径小于主核的1/3，结构和颜色深浅同主核相似，转动显微镜微调时，与主核处于同一水平面。每个试验组镜检5个以上的根尖，每个根尖至少观察1 000个分散良好、质核清晰的间期细胞，统计微核细胞数。每个试验组统计3次，取平均值，计算微核率，微核率（MCN）=微核个数/观察细胞总数×1 000‰[10]。

根据国家环境保护总局用蚕豆根尖微核试验对水质污染评价的“污染指数”概念，水体受污染程度采用污染指数（PI=待测水样微核率/阴性对照组微核率）来划分[7]。

1.2.4 过氧化氢、超氧化物歧化酶和丙二醛含量的测定 以蚕豆胚根为材料，H2O2、MDA和SOD测定采用南京建成生物工程研究所相应的试剂盒，按照说明书所述步骤进行操作。观察、测试和分析均重复3次。

1.2.5 数据分析 用GraphPad Prism 5软件进行作图；用SPSS 19.0软件对各组样本的平均微核数进行t检验，并检测不同处理组与阴性对照组的差异显著性[11，12]。

2 结果与分析

2.1 渭河宝鸡段水质污染状况

由表1可知，阴性对照组微核率为0.67‰，阳性对照组微核率为9.67‰。因不同试验材料监测的结果有很大差异，故较低的微核率是试验成功的关键因素之一。根据1986年颁布的《环境监测技术规范》规定，作物微核率不应高于10.00‰[7，13]，本研究中，各试验组的微核率都在10.00‰以下，符合污染检测要求。渭河宝鸡段各水样处理蚕豆根尖后，都出现了不同程度的微核（图1），上游水样处理组的微核率为1.23‰，污染指数是1.84，为轻度污染；中游水样处理组的微核率为1.65‰，污染指数是2.46，为中度污染；下游水样处理组的微核率为1.74‰，污染指数是2.60，为中度污染。各试验组的微核率都明顯高于阴性对照组，且上游、中游至下游蚕豆根尖微核率和污染指数都呈上升趋势。用SPSS 19.0软件对表1数据进行t检验，结果表明，上游水样微核率显著高于阴性对照组（P<0.05），中、下游水样微核率都极显著高于阴性对照组（P<0.01）。endprint

2.2 过氧化氢、超氧化物歧化酶和丙二醛含量的变化

植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内活性氧代谢的平衡被破坏而有利于活性氧（ROS）的积累，H2O2便是活性氧之一。由图2可知，蚕豆胚根阴性和阳性对照组H2O2含量分别为1.335和7.463 mmol/g；上游、中游和下游水样蚕豆胚根的H2O2含量分别为2.442、3.456和4.578 mmol/g。上游和中游水样蚕豆胚根的H2O2含量显著高于阴性对照组（P<0.05）；下游水样H2O2含量极显著高于阴性对照组（P<0.01）。

MDA是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，测定其含量可以评价质膜受损程度。阴性和阳性对照组蚕豆胚根的MDA含量分别为7.153和23.792 nmol/mg；上游、中游和下游水样蚕豆胚根的MDA含量分别为8.873、12.962和18.357 nmol/mg。上游水样蚕豆胚根的MDA含量与阴性对照组无显著差异，中游和下游水样MDA含量显著高于阴性对照组（P<0.05）。

阴性和阳性对照组蚕豆胚根的SOD活性分别为653和706 U/g蛋白；上游、中游和下游水样蚕豆胚根的SOD活性分别为732、861和753 U/g。上游和下游水样SOD含量与阴性对照组无显著差异，中游水样SOD含量极显著高于阴性对照组（P<0.01）。

3 小结与讨论

微核的形成体现了环境的污染状况，反映了细胞遗传物质损伤的程度，而遗传物质损伤又是机体癌变的原因之一，因此微核试验被认为是反映机体接触“三致”物质的敏感指标之一[5，14]。蚕豆根尖对各种诱变因子反应十分敏感，当诱变因子剂量在一定范围内时，微核产生的数量与诱变因子的剂量呈正比。Dong等[15]认为焦化废水可诱导蚕豆和大麦根尖细胞产生微核，并呈剂量依赖关系，且蚕豆比大麦更灵敏。Shahid等[16]用土壤中的有机金属混合物来培养蚕豆，檢测其微核率，确定土壤的质量和其对植物的遗传毒性。赵志国等[17]利用蚕豆根尖微核技术检测长江涪陵段水质，以不同取水点对蚕豆根尖进行染毒处理，表明长江涪陵段水质受到了不同程度的污染，靠近城区和工厂附近的污染尤其严重。没有细胞的分裂活动，即使毒性很强的遗传毒物，也无法通过染色体畸变、微核等细胞遗传学的手段监测[18]，所以在利用细胞遗传毒理学进行监测时，必须保证测试材料具有一定的细胞分裂水平，这是正确检测的必要条件。

近年来植物毒性试验作为一种对环境污染物毒性检测和评价的方法越来越受到人们的关注，本研究以蚕豆为材料，研究了污水对蚕豆根尖细胞微核率、H2O2、MDA含量及SOD活性的影响，旨在为污水的毒性检测、安全排放及生物监控指标的确定提供一定的理论依据。本研究结果表明，在污水成分的胁迫下蚕豆胚根生长发育异常，出现生长缓慢、褐化、弯曲生长、根尖坏死等症状。通过检测，H2O2和MDA都呈升高趋势，这与徐秋曼等[19]、刘会杰等[20]的研究结果一致。即随着水污染程度加重，H2O2等活性氧（ROS）积累，未被及时清除的过量H2O2等ROS作用于DNA分子而导致染色体断片，进而形成微核。MDA升高则意味着细胞膜脂过氧化的程度增加，膜损伤加剧。本研究中SOD活性先升后降，这可能与抗氧化酶参与污水胁迫的抵抗有关，是植物体对外界环境变化的一种响应。

试验所取渭河宝鸡段上、中、下游水样的污染程度表现为下游=中游﹥上游，即渭河水流经宝鸡市之前就已有一定程度的污染，流经该市区时，河水又受到了污染。这与水样所处地理位置、沿途接纳两岸工农业废水和生活污水有关。通过对渭河宝鸡段水样的检测表明，水体中具有一定的遗传毒性，可显著诱导蚕豆根尖细胞微核率的上升。造成此种结果的原因是在林家村水坝（上游）附近，农业种植面积较大，农业种植施用化肥及农村养殖造成的污染加剧；在渭河大桥（中游）和潘家湾大桥（下游），由于造纸、化工等工厂集中，受工业废水的影响，水中化学成分十分复杂，水质进一步下降。且由于居民区集中，一些配套污水管网和污水处理设施建设滞后，生活污水处理达标率低。生活污水和垃圾较多，对水体污染程度较高。尽管水流自身具有自净能力，但枯水期生态水严重不足，造成生态基流短缺，水体自净能力难以充分发挥，直接影响渭河水质。

渭河作为关中地区的“母亲河”，影响着关中地区的农业经济社会发展，而人类的经济生产、生活活动也影响着渭河水质的变化，水污染又会间接威胁到人们的健康。改善渭河流域水生态环境，是贯彻落实党中央、国务院提出的经济、社会、环境协调发展战略的客观要求，对于渭河流域经济社会可持续发展具有重要意义。目前，各部门联合作战，对渭河宝鸡市区段实施改造、提升，进行渭河综合治理、河道生态治理，旨在建立亲水、生态、环保、景美的新河道。

参考文献：

[1] 董玉瑶.内陆水域污染生态学——原理与应用[M].北京：科学出版社，2001.

[2] 金彩霞，毛 蕾，司晓薇.3种磺胺类兽药单一及复合污染对不同作物根尖细胞的微核效应研究[J].农业环境科学学报，2015， 34（4）：666-671.

[3] 仪慧兰，孟紫强.SO2对蚕豆根尖细胞微核的诱导作用[J].生态学报，2003，23（2）：292-296.

[4] GRANT W F. Higher plant assays for the detection of chromosomal aberrations and gene mutations：A brief historical background on their use for screening and monitoring environmental chemicals[J].Mutation Research，1999，426（2）：107-112.

[5] MA T H. Viciacytogenetic tests for environmental mutagens： A report of the U.S. environmetnal protection agency gene-tox program[J].Mutation Research，1982，99（3）：257-271.endprint

[6] 董铭洪.环境污染与生态修复[M].北京：科学出版社，2003.

[7] 国家环境保护局.环境监测技术规范——生物检测（水环境部分）[M].北京：中国环境科学出版社，1986.

[8] 孔志明.环境毒理学[M].南京：南京大学出版社，2004.

[9] 涂俊芳，罗 勋，胡云虎.蚕豆根尖细胞微核技术监测十涧湖水质[J].生物学杂志，2008，25（4）：65-67.

[10] 陶少武.初生根长度对蚕豆根尖细胞微核率影响的研究[J].广西植物，2005，25（5）：447-448.

[11] 李 宏，黄晓天.表面活性剂诱发的蚕豆根尖细胞微核及染色体畸变[J].环境与健康杂志，2005，22（5）：351-352.

[12] 李晓毅，徐兆棣.SPSS软件在概率统计课程设置中的主导地位及应用[J].沈阳师范大学学报（自然科学版），2010，28（1）：24-26.

[13] 封少龙.应用蚕豆根尖微核技术研究混合污染物及土壤、沉積物和垃圾焚烧灰的遗传毒性[D].广州：中国科学院研究生院（广州地球化学研究所），2004.

[14] SHAHIN S A，EL-AMOODI K H. Induction of numerial chromosome aberrations during DNA synthesis using the fungicides nimrod and rubigan-4 in root tips of Vicia fabal[J].Mutation Research，1991，261（2）：169-176.

[15] DONG Y R，ZHANG J T. Testing the genotoxicity of coking wastewater using Vicia faba and Hordeum vulgare bioassays[J].Ecotoxicology and Environmental Safety，2010，73（5）：944-948.

[16] SHAHID M，PINELLI E，POURRUT B，et al. Lead-induced genotoxicity to Vicia faba L. roots in relation with metal cell uptake and initial speciation[J].Ecotoxicoogy and Environmental Safety，2011，74（1）：78-84.

[17] 赵志国，郭红娟，王任翔.应用蚕豆根尖细胞微核技术评价广西平乐锰矿废弃地土壤的污染状况）[J].广西植物，2011，31（1）：102-106.

[18] KANAYA N，GILL B S，GNNER I S，et al. Vicia faba chromosomal aberration assays[J].Mutation Research，1994，310：231-247.

[19] 徐秋曼，陈 宏，程景胜，等.镉对油菜叶细胞膜的损伤及细胞自身保护机制初探[J].农业环境保护，2001，20（4）：235-237.

[20] 刘会杰，李 胜，马绍英，等.H2O2胁迫下豌豆初生根及抗氧化酶系统对外源Ca2+的响应[J].草业学报，2014，23（6）：189-197.endprint