烟草黑胫病抗性鉴定研究现状与展望

方敦煌，肖炳光，焦芳婵，曾建敏，吴兴富

云南省烟草农业科学研究院，云南昆明 650021

烟草黑胫病（tobacco black shank）是由卵菌Phytophthorɑ nicotiɑnɑe引起的土传病害，在温带、亚热带和热带发生程度较重，是我国烟草的第二大病害[1-2]。已有研究表明，最经济有效的防治措施是选育和应用抗病品种。国外抗黑胫病育种始于20世纪20年代，在育种过程中发现Florida 301和Beinhart 1000-1是黑胫病的抗源[3]，由于黑胫病危害的逐年增加，研究人员规模化开展了抗源的筛选，将抗黑胫病较好的野生种N. plumbɑginifoliɑ、N. longi florɑ、N.stocktonii、N. nesophilɑ和N. repɑndɑ中的抗性转育至普通栽培烟草[4-6]，渐渐形成Florida 301、Beinhart 1000-1、Coker 371-Gold、N. plumbɑginifoliɑ和N. longi florɑ等5大抗源育种体系[3]。我国从20世纪50年代开展抗黑胫病育种以来，不懈探索抗性鉴定方法，持续开展烟草种质资源与新品种（系）的抗病鉴定工作，但在抗源利用、抗性鉴定技术、工作程序上还有待进一步改进完善。本文在梳理国内外有关文献的基础上，结合自身工作实践，对烟草黑胫病的抗性鉴定研究现状进行了总结与展望。

1 抗性鉴定方法研究进展

烟草黑胫病菌主要集中在0～5 cm的土层活动，对烟草的田间侵染发生于近地表的根及茎基部，偶尔由带菌雨水飞溅侵染叶片[1-2]。烟草黑胫病的抗性鉴定是一个依据侵染特性接种病菌、观察病症反应并评价的过程，按接种部位分为根部、茎部和叶部接种等3种方法[4-11]；按鉴定时期划分为苗期和成株期2种方法；近年来，出现了针对特定抗源开发的分子标记辅助抗性鉴定方法。为了与现行的烟草品种抗病性鉴定标准[12]一致，本文按鉴定时期论述烟草黑胫病抗性鉴定方法。

1.1 苗期鉴定

苗期接种方法较多[13]，用于抗性鉴定的可归纳为菌丝块创伤茎/根接种法（菌谷法）、游动孢子或菌丝体悬浮液茎注射接种法[14]（注射法）、游动孢子悬浮液浸根接种法（游动孢子浸根法）、毒素胁迫种子萌发法[15]（毒素法）等4种方法。注射法由于操作比较繁琐、费时，难以实现苗期抗性鉴定的规模化。因此，本文重点评述菌谷法、游动孢子浸根法和毒素法3种抗性鉴定方法进展。

1.1.1 菌谷法

菌谷法于20世纪80年代初提出[16]，被烟草品种抗病性鉴定标准[12]采用，并规范了抗感对照品种、菌谷接种量、病害诱发条件、病害调查方法和调查时间[17]。在实际应用中，菌谷法不断改进。云南省烟草科学研究所[18]优化了抗性指标，将菌谷埋入烟苗茎基部接种后以第5 d、7 d和10 d共 3次病情指数的平均值作为测试品种的抗性指标。贵州省烟草科学研究院[19]将菌谷埋入烟苗根部接种后3～10 d调查病情，评价抗性，大大减少了工作量。河南省农业科学院烟草研究所[20]在病菌菌丝平板上点播表面消毒的烟草种子，对萌发的种子进行发病率统计、抗感水平评价，大幅度缩短了鉴定时间。

此外，菌谷法还衍生出另一种方法——茎基部创伤菌丝块贴接法[21]。该方法接种时菌丝块须准确贴接在创伤伤口上，在确保人工创伤伤口大小一致[21-22]、定量菌丝块贴接与保湿一步到位[23]的前提下，可进行规模化筛选和验证[24]。

1.1.2 游动孢子浸根法

游动孢子浸根法由Gooding等[25]提出，Stokes等[26]将其用于烟草品种抗性鉴定，Jaarsveld等[11]将其进一步发展为烟草品种抗性鉴定方法，梁元存等[27]验证其鉴定结果可靠。但以上研究在接种前需要洗净烟草幼苗根部，对烟苗根系造成较大的伤害，接种时烟苗根部接触游动孢子的表面积大，选择压力过大，存在发病偏重、中抗材料易被归入感病类型等问题。云南省烟草农业科学研究院[28]对此进行了改进，采用两段式漂浮育苗方式[29]培育烟苗，刮根、浅盘定量浸根接种，根系创伤适中、接种量均一化、中感与中抗易于区分，而且鉴定对象规模化，有效提高了鉴定的规模和效率。

1.1.3 毒素法

毒素法是根据寄主植物对毒素和病害反应的一致性原理，用毒素代替病原物对植物品种个体、器官、细胞团和原生质体进行抗性筛选的方法，可以加速抗病育种进程[30]。烟草黑胫病菌产生的毒素[31]可以作为选择压筛选突变体[32-33]或评价抗性[34]。中国农业科学院烟草研究所[15]采用毒素液浸种，统计种子发芽率评价抗性，但尚需对毒素进行定量化、优化[35]才可高通量、快速鉴定烟草黑胫病抗性。毒素法较其他方法技术要求更高、环境条件更苛刻、操作难度大，建议作为辅助抗性鉴定方法。

1.2 成株期鉴定

成株期鉴定[12]主要在自然或人工病圃中进行。自然病圃的初侵染源来自连作烟田的烟草黑胫病病株，而人工病圃的初侵染源主要是人工添加的烟草黑胫病菌谷物培养物（即菌谷），两者均可通过灌溉维持土壤含水量的饱和状态以诱发病害。按烟草病虫害分级及调查方法[17]规定，于发病初期、盛期、末期各调查1次，以感病对照品种病情指数最先达到60及以上的调查数据为依据进行抗病性评价，感病对照品种病情指数不低于60时试验及评价有效。

成株期鉴定反映了品种的实际抗性水平，是品种推广应用必需经过的阶段。在应用标准方法进行成株期鉴定时，技术细节不断得到充实。云南省烟草农业科学研究院明确了自然病圃选择的条件[36]，并对接种方法进行了改进，采用层饼式接种覆盖形成人工病圃、间歇式保湿诱发病害，避免了环境条件对鉴定结果的影响，提高了抗性鉴定的准确性与重现性[37]。

1.3 分子标记辅助抗性鉴定

分子标记辅助抗性鉴定法不需生物接种，可直接用于育种材料的抗性鉴定，但前提是抗源的遗传特性明确。遗传分析表明，N. plumbɑginifoliɑ、Coker 371-Gold和N. longi florɑ的抗性为显性单基因控制，Florida 301、Beinhart 1000-1的抗性由微效多基因控制[38-40]。Johnson等在探索Coker 371-Gold的黑胫病抗性基因来源时，鉴定出6个与黑胫病抗性连锁的RAPD标记[41]，并证明其可用于分子标记辅助抗性鉴定[42]。何彬等[43]研究表明31份表型鉴定为抗性的材料中，14份含有抗性RAPD，占比45.16%，说明抗性材料的抗病基因来源比较集中。高亭亭等[44]从Beinhart 1000-1中筛选到5个与黑胫病抗性紧密相关的QTLs，陈迪文等[45]利用白肋烟抗黑胫病品种B37检测到7个黑胫病抗性相关QTLs，这些研究结果为精细定位抗病QTL奠定了基础，推动了微效多基因控制的烟草黑胫病分子标记辅助选择。

2 种质资源与新品种（系）的抗病鉴定

20世纪80年代以来，我国对烟草品种抗黑胫病鉴定方法与抗性指标进行了探索[16]，1996年在参考国内外烟草及其他作物品种抗病鉴定方法的基础上，借助多年的实践，制订形成了包括烟草黑胫病在内的4种病害抗性鉴定行业标准[46]，2008年修订、提升为国家标准[12]。同时，利用行业品种区域试验平台，形成了南北育种中心为主的烟草品种区域试验网络[47]，并对黑胫病抗性品种审定提出了明确要求[48]，烟草品种黑胫病抗性鉴定工作由专门的鉴定单位规范进行。

2.1 种质资源的抗病性

为搜集和寻找烟草黑胫病抗源，20世纪80年代我国重点开展了品种资源的收集整理，中国农业科学院烟草研究所对1000多份烟草资源进行反复验证，筛选出高抗黑胫病0号生理小种的资源20多份，约占1.33 %，抗病材料125份，占比8.33 %[1]。

南方育种中心自成立以来在行业品种区域试验平台上持续开展黑胫病抗性鉴定。许美玲等[49]采用大田病圃人工接种0号生理小种菌谷对213份资源进行抗病鉴定，发现高抗品种17份、占7.98 %，中抗品种60份、占28.17 %，抗病品种48份、占22.54 %。黄成江等[50]采用菌丝块创伤茎基部接种0号生理小种，在病圃测定了52份烤烟品种的抗性，结果表明高、中抗品种占30.78 %。李梅云等[51]采用苗期菌谷接种0号生理小种对146份烟草种质开展抗性鉴定与评价，结果表明抗性种质有118份，占比80.82 %。于海芹等[52]采用0号生理小种游动孢子浸根法对新引进的288份烟草种质进行了抗性鉴定，筛选出17份抗病资源和23份中抗资源。何彬等[53]对66份烟属野生种的黑胫病（0号及1号生理小种）抗性进行了评价，筛选出14份抗0号生理小种、15份抗1号生理小种、11份资源兼抗0号和1号生理小种。

此外，研究人员在河南、湖南、贵州等黑胫病常发区开展了种质资源抗性鉴定。刘风兰等[54]通过人工病圃鉴定，从26份材料中筛选出5份高抗资源、13份抗病资源。李艳[55]采用苗期菌谷法对26份晒烟资源进行了抗性测定，发现13份抗病资源、3份中抗资源。向世鹏等[56]采用人工病圃接种1号生理小种，对49份种质资源进行了抗病性鉴定，结果表明24份材料表现为抗病、7份材料表现为中抗。

2.2 新品种（系）的抗病鉴定

随着黑胫病抗性鉴定技术的成熟，抗黑胫病育种取得了显著成效，育成的抗病品种比例大幅度提高[57-59]，引进的抗病品种有K326[60]和NC89[61]，育成的抗病或中抗品种有云烟85[62]、云烟87[63]、中烟100[64]、龙江911[65]、云烟97[66]、南江3号[67]、云烟100[68]、秦烟96[69]等，均已先后成为烤烟主栽品种，累计种植面积均已超过100000 hm2[70]。

3 问题与展望

3.1 抗源利用不足，抗性和品质难以兼顾

烟草生产上应用最广泛的抗源来自N. plumbɑginifoliɑ和 Florida 301。我国 抗黑胫病育种主体亲本G28、K326、NC82的抗源来自Florida 301，缺乏来自N. plumbɑginifoliɑ的抗源[71]。虽然我国现存的烟草品种资源达到4312份[72]，但对黑胫病的抗性鉴定不够，缺乏抗性、品质遗传等方面的深入研究，抗性和品质难以兼顾。需要规模化筛选抗源、分析遗传规律、挖掘抗病基因、筛选抗性分子标记，采取远缘杂交、生物技术等多种方法创新抗源，通过复式杂交、修饰回交、混交-混选等育种体系，实现抗性和品质的同步改良。

3.2 鉴定方法的技术细节需进一步明确

国家标准方法[12]中，成株期鉴定涉及自然病圃与人工病圃。人工病圃与自然病圃相比，能够较好地控制病菌的小种类型、致病力、数量和分布，且条件更优越，可保证病圃发病适中，准确性、重复性更好，建议在评价抗性时，以人工病圃鉴定为判别依据、自然病圃鉴定为参考。这种观点已被烟草品种农业试验技术规程[47]所采用。

国家标准方法[12]中，菌谷法技术有待完善。菌谷有根部、茎基部以及根部和茎基部同时接种3种方式。田间黑胫病调查时发现，成株期的茎基部是病菌最易受攻击的部位、显症比根部快、病症类型占绝对优势[1,73]，且茎基部接触病菌时间长，在整个生长季都存在侵染的可能；而根部侵染主要发生在苗期、大田早期，地上部症状不明显或者不表现症状。因此，实际操作中可以茎基部接种为主，根部以及根部和茎基部同时接种为辅。此外，游动孢子浸根法可作为标准的补充方法，毒素法可作为标准的辅助方法。

国家标准方法[12]采用了抗、中抗、感病对照，增加了鉴定结果的纵向和横向可比性，但没有兼顾抗、中抗品种对照，抗病评价指标过于琐碎，不便于国家标准与行业标准的衔接。建议在病害调查时，关注抗、中抗、感病3个对照品种的发病进程，按行业标准的病情指数指标评价抗性，以“感病对照品种病情指数不低于75、抗和中抗对照符合抗性评价指标”作为试验及评价有效的判别依据。若感病对照品种病情指数介于50～75时，可借鉴棉花黄萎病的相对抗病指数[74-75]进行评价。当感病对照品种病情指数低于50时，试验及评价无效。

3.3 鉴定工作程序尚需完善

在烟草黑胫病抗性鉴定的工作中，有必要探索不同方法鉴定结果的可比性[35]、苗期与成株期鉴定的相关性。由于不同烟草品种的耐病性和恢复力不同、以及组织器官的差异[73]，一些品种苗期和成株期抗病结果不一致，因此苗期鉴定适合于大批烟草种质和新品种（系）的抗性检测筛查。对于即将推广种植的重点材料仍应进行成株期鉴定，经苗期筛选出的抗性材料和品种（系），需经过成株期至少2点、2年的人工病圃鉴定，再进行品种审定和大面积推广。

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