两种豆类材料的纳豆制品纳豆激酶活性动态分析

刘超群

（北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏 银川 750021）

纳豆是一种起源古老而传统的可食用发酵产品，其类似于豆豉，至今有上千年的历史文化[1]。纳豆是以大豆为原料经草枯芽孢杆菌发酵而来的，具有溶血栓、抗肿瘤、降血压、防止骨质疏松、抗菌消毒等生理功能[2]。其最主要的功能是能够溶解人体内难以溶解的纤维蛋白。血栓一直是老年性心血管疾病难题，原因是血栓中含有一种不溶性纤维蛋白，而纳豆激酶能有效地溶解血栓中的不溶性纤维蛋白，因此纳豆激酶成为了新一代的医用溶栓剂，也作为一种能预防血管栓塞的保健食品被人们所接受。

国内外很多学者对其基本性质、作用、制备方法及纯化技术方面的研究都取得了很大的成就。而且纳豆的保健功效都是通过纳豆激酶来反映的，在1987年就有学者发现纳豆激酶有很强的溶栓功能，所以纳豆激酶的活性对其保健功效至关重要。

表1 大豆组和绿豆组的纳豆激酶OD值

1 试验仪器与材料

1.1 试验材料

纳豆菌购自吉林省雁鸣湖大豆生物科技有限责任公司，对甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯、15%三氯醋酸、10%亚硫酸钠、5%变色酸、2%高锰酸钾均购自天津市大茂试剂厂，pH值为8的磷酸缓冲溶液购自上海双螺旋生物科技有限公司。

1.2 试验仪器

水浴锅（太仓市华利达实验设备有限公司）；MS304S分析天平(奥豪斯仪器（常州）有限公司)；自动生化分析仪 ADVIA 1800(西门子公司)。

2 试验方法

2.1 试验材料预处理

大豆经精选后清洗，经高温灭菌1 h后，在无菌条件下按原料重量 2%～4%的接种量接种纳豆芽孢杆菌，之后于37℃、85%湿度条件下的恒温恒湿培养箱中发酵培养24～36 h即可。

2.2 纳豆激酶样品活性测定

纳豆激酶活性采用TAME法测定[3]，以大豆和绿豆为原料进行纳豆发酵，每4 h（从发酵至成熟时间48 h内）提取1次纳豆制品上清液，分别加入TAME、pH值为8的磷酸盐缓冲液和上清液，并设置空白对照组和重复组，空白管以磷酸盐缓冲液代替。在37℃水浴锅中放置0.5 h后即进行降温，同时加入15%三氯醋酸、2%高锰酸钾、10%亚硫酸钠和5%变色酸，放入沸水浴中显色反应25 min，取出后冷水浴冷却，测定其在574 nm处的吸光度。具体数值见表1。

3 试验结果

经发酵后的两种豆类色泽透亮，且表面裹有薄薄一层微黄丝状物质。纳豆激酶粗制品就是将其研磨成粉状。将纳豆制品从接种至发酵完成过程中的不同时间段检测其OD值，结果表明，两种原材料的纳豆激酶在0～12 h活性逐渐增强，12 h活性最强（大豆为2.230，绿豆为1.679），12 h后逐渐减弱，至20 h接近失活。两种材料的纳豆制品从接种至发酵完成过程中，以大豆为原材料的纳豆激酶活性大于以绿豆为原材料的纳豆制品。

4 讨论

据报道，目前全球中老年每年因患血栓死亡人数高达1 500万，而中国就约有300万，血栓疾病严重影响着人类的健康[4]，所以开发溶栓型药物迫在眉睫。目前溶栓型药物大多数副作用大、价格昂贵且都是注射用药，增加了临床治疗的难度，而纳豆激酶的高溶栓特性、价格便宜且高效就满足了条件。其可以溶解血栓、预防和改善心脑血管和高血压等疾病。有学者通过动物试验表明，纳豆粗提物可降低血脂水平，在降低血液黏度方面有很显著的效果[5],同时由于纳豆激酶具有可口服、安全性高、价格低和纤溶活力强等优势，成为近年来溶栓类产品开发研究的热点[6]。

测定纳豆激酶活性的方法，根据测定原理可大致分为2种：一种是以纳豆激酶的水解活性为基础来测定其活性,如TAME法；另外一种是利用溶解纤维蛋白的特性测定其活性，如纤维蛋白平板法等。熊迎新等通过对TAME法和纤维蛋白平板法进行了比较，发现TAME法因灵敏度高、操作简便，可作为一种常规检测方法。其是利用常规纳豆菌株在一定条件下发酵得到两种原料的纳豆激酶粗制品，所以本试验以市场上普通的大豆和绿豆为原料，活性测定采用TAME底物法。结果表明，两种纳豆制品的最佳食用时间为发酵至12 h左右，在这个时间段纳豆激酶的活性最强，药用、保健功效最佳，且以大豆为材料的纳豆制品的纳豆激酶活性大于绿豆材料纳豆制品。纳豆及纳豆激酶拥有的这些功能优势为开发溶栓型药物和保健品奠定了理论基础。提纯的纳豆激酶经过进一步的加工开发为药物指日可待，能最大限度地发挥纳豆激酶在溶血栓和降血脂方面的功效，造福于人类健康。

[1]高瑞萍，刘辉，刘嘉，等.纳豆的研究进展[J].食品与发酵科技，2011，47(01)：23-26.

[2]代增英，冯建岭，李迎秋，等.纳豆及纳豆激酶的研究进展[J].山东食品发酵，2013(01)：46-50.

[3]熊迎新，尹宗宁，杨超，等.纳豆激酶活性测定方法的研究[J].药物生物技术，2006(02)：140-143.

[4]刘莅欣，胡桃红.血栓性疾病抗栓治疗的研究进展[J].中国临床医生，2013，41（05）：1-3.

[5]徐章华，邵玉芬，朱国辉.苏子油对大鼠血脂及血液流变性的影响［J］．营养学报，1997，19(01)：11-15．

[6]CAI D，W EI X，QIU Y，et al.High-level expression of nattokinase in Bacillus liche niformis by manipulating signal peptide and signal pepti-dase[J].J Appl Microbiol，2016，121(03)：704-712.