大豆耐盐性研究进展

，，，

(南京农业大学 大豆研究所/国家大豆改良中心/作物遗传与种质创新国家重点实验室，江苏 南京 210095)

0 引 言

大豆中蛋白质含量约40%，油分含量21%，是世界上种植面积最广的油料作物，占2013年世界植物油种子产量的56%[1]，在满足人类饮食、动物饲料和生物油的需求中起着重要的作用，同时它作为工业产品的原料也被广泛利用，因此，全球对大豆的需求量在不断增加。在大豆生长发育过程中，各种生物和非生物胁迫会对大豆造成不同程度的影响，最终导致大豆产量和品质降低，盐害则是其中一种主要的非生物胁迫。大豆作为中度耐盐农作物，盐害会抑制大豆种子的萌发和营养生长[2]，阻碍大豆根瘤的形成[3]，在盐度值超过5 ds·m-1时，大豆的产量会明显降低[4]。大豆耐盐品种的选育则成为应对盐害的有效策略之一。

众所周知，传统育种效率低，育种周期长，经常伴有非生物抗性与低产性状连锁等不利因素，大大限制了传统育种的使用范围[5]。而现代生物技术培育耐盐品种则具有高效、省时和省力等优点，已成为当前耐盐育种的研究热点。目前，常用的育种手段包括分子标记辅助育种和转基因技术育种。值得肯定的是，大豆耐盐育种工作已取得显著进展，本文对近年来大豆耐盐研究进行概括总结，主要包括盐胁迫对大豆的危害、已定位到的耐盐相关QTL和大豆耐盐相关离子转运蛋白基因及其耐盐机制3个方面，期望能对促进耐盐高产大豆育种工作进程提供参考和理论基础。

1 盐胁迫对大豆的影响

植物生长周期主要包括萌发期、营养生长期和生殖生长期。盐害会对大豆生长周期造成不利影响，而大豆的耐盐程度也因不同发育阶段而异[6]。

1.1 盐胁迫对大豆芽期的影响

萌发期作为大豆生长周期的第一阶段，是大豆生产的主要一环，盐胁迫下的高发芽率才能保证存苗率和再生产。在低盐条件下(0.05%和0.1%NaCl)，大豆种子的发芽会有明显的延迟，盐浓度越高，发芽百分比越小[7]。邵桂花等[8]发现，大豆芽期的耐盐性顺序为：吸胀期>根出现期>根生长期>侧根生长期。Kan等[9]研究也同样发现，在191份栽培大豆品种中，大豆吸胀率受盐胁迫影响较小，发芽率和发芽指数受到盐胁迫影响较大，而且在盐胁迫下，大豆发芽率的变异度较大，在2年环境中都有类似的情况，说明大豆芽期的发芽率是较稳定的明显的耐盐指标。该研究还发现，在盐胁迫下，大豆相对盐害吸胀指数与大豆发芽率、发芽指数成显著负相关关系，这个结果同样出现在Kan等[10]另一研究中。Zhang等[11]发现，在大豆萌发期，100 mM NaCl处理257份栽培大豆7 d后，大豆的主根长、根鲜重、根干重、幼苗生物量以及下胚轴的长度均明显低于对照，其中根鲜重和根干重受抑制最为明显，比对照最高下降了95.7%和87.4%，并且二者在2年里的变异范围都很大，说明其也可以作为耐盐指标稳定遗传。寇贺等[12]发现，低浓度(10～20 mM ) NaCl对大豆相对发芽率、活力指数、下胚轴长、根长和侧根数有促进作用，但随着NaCl浓度的升高，大豆相对发芽率、活力指数、下胚轴长、根长和侧根数会受到抑制。进一步研究发现在大豆芽期，高盐环境下，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的活性明显降低，丙二醛(MDA)含量显著增加。作者认为，盐胁迫引起的离子毒性会降低过氧化酶系统活性，致使活性氧大量累积，进而对细胞膜系统及细胞内酶系统造成破坏，降低了大豆芽期的耐受性，最终影响大豆的发芽。而徐芬芬等[13]研究发现，高盐会显著降低吸水速率和营养元素的活化效率，抑制大豆种子的吸胀作用，进而降低淀粉酶活性和蛋白酶活性，这或许是高盐胁迫下大豆发芽率下降的另一原因。

1.2 盐胁迫对大豆苗期阶段的影响

近年来，大豆耐盐性研究主要集中在苗期阶段。当用220 mM NaCl处理大豆幼苗后，其生长率只有对照的5%，当浓度提高到330 mM时，大豆几乎停止生长，330 mM NaCl溶液处理大豆种子，其发芽率还可达到81%，这说明大豆苗期对盐胁迫的敏感度要比大豆芽期更为明显[14]。邵桂花等[15]指出，大豆在3叶1心期是盐敏感时期，盛花期(R2期)和结荚期(R4期)对盐胁迫的耐受能力上升，各器官生物量和总生物量均比正常条件培养下有所下降，但未达到显著水平，植株整体呈现绿色，长势较好。盐胁迫下的植株与正常培养的植株相比较，株高降低，主茎节数和分枝数均减少，而耐盐品种的变化小于盐敏感品种。Li等[16]研究发现，用NaCl处理大豆幼苗1 h内，叶片出现萎蔫下垂，并且在NaCl处理10 min内气孔导度下降到基线的50%以下。然而NaCl处理8 h后，叶片又得到恢复，表明大豆在8 h内已经在渗透调节机制的作用下重新启动水分运输途径，恢复蒸腾作用[16]。在盐处理数天后，植株体内Na+和Cl-逐渐积累，损害正常代谢过程并降低光合效率而影响植株正常生长，在大豆叶片上还会出现焦灼的盐害症状，一段时间后叶片萎蔫脱落，最终导致植株死亡。宁丽华等[17]研究发现，150 mM NaCl能显著降低大豆幼苗的SPAD 值、净光合速率、气孔导度和蒸腾速率。然而进一步研究发现，盐胁迫下，同盐敏感大豆相比，耐盐大豆叶片具有较低的Na+含量，较高的K+和P含量，光合速率也更强一些，这可能是耐盐大豆品种比盐敏感品种具有较强耐盐特性的原因之一。罗云庆等[18]发现，盐胁迫下大豆植株表现出叶片枯黄衰亡症状，茎节数减少，株高降低，生物量积累都显著降低。随后测定根、茎和叶中的Na+、K+和Cl-发现，耐盐性强的大豆品种，其茎和叶片Cl-含量低于盐敏感的品种，且 K+/Na+要高于盐敏感的品种，可见维持相对较高K+含量对提高耐盐性是大有裨益的。

1.3 盐胁迫对大豆生殖生长阶段及根瘤的影响

盐胁迫会对大豆的产量和品质造成不利影响。常汝镇等[19]研究发现，盐胁迫下，大豆的分枝数和单株荚数减少，单株粒重和百粒重降低，从而造成减产现象。测产发现，当盐浓度达到14～15 ds·m-1时，平均产量会减产为正常生长下的47.5%，并且盐敏感品种受到盐害影响要显著大于耐盐品种；低浓度(14～15 ds·m-1)下，大豆蛋白质的含量降低，脂肪含量下降，高浓度(18～20 ds·m-1)则出现相反的现象，而不饱和脂肪酸的含量受到的影响则相对较小。而在另一研究中，Ghassemi-Golezani等[20]发现，随着盐胁迫程度增加，大豆油分的积累速率几乎不受影响，但蛋白积累速率降低，蛋白和油分积累时间减少，导致大豆籽粒蛋白和油分含量下降，蛋白百分比下降而油分百分比上升，最终影响了籽粒的品质。作者认为，籽粒蛋白含量和百分比随着盐害程度增加而下降，可能是由盐胁迫下大豆水分吸收减少，根系渗透势降低引起的氮代谢紊乱或硝酸盐吸收被抑制而引起的。虽然籽粒油分百分比上升，可能是由蛋白百分比下降以应对盐胁迫造成的，但其籽粒的油分含量最终还是下降的。

根瘤是豆科植物独有的特征。而盐胁迫对根瘤的影响也是大豆耐盐研究的重点。有研究报道盐胁迫会影响大豆的结瘤，减少根瘤的数量和生物量，降低固氮效率[21]。造成这一现象的原因是固氮菌的有氧呼吸作用被盐胁迫抑制，导致根瘤中的豆血红蛋白含量降低，固氮所需的能源被耗竭。另外，盐胁迫强烈地抑制结瘤因子活性，从而阻碍了共生过程的开始[22]。

综上所述，盐胁迫下，大豆从萌发期、营养生长、生殖生长阶段及根瘤产生都会受到不同程度的不利影响，最终导致大豆减产和品质下降。从生理的角度上看，高盐造成渗透势降低，水分吸收减少，营养元素吸收不平衡进而导致离子毒害及次级氧化胁迫等，是造成大豆生长发育迟缓受阻并减产，甚至死亡的主要原因。

2 大豆耐盐相关性状的分子遗传研究

众多研究工作表明，植物耐盐是一个复杂数量性状，受多基因控制[23-25]。基于连锁分析的QTL作图(QTL mapping) 和基于连锁不平衡(Linkage disequilibrium,LD)的关联分析(Association analysis)，是目前解析复杂数量性状位点(Quantitative trait loci,QTL)的两个主要方法。目前，利用这两种方法进行解析大豆耐盐相关性状的分子基础已经取得长足的进展。

2.1 大豆耐盐性状的QTL作图

近年来，大量研究利用大豆种内或种间重组自交系群体，通过连锁分析对大豆不同生育期耐盐相关性状进行了QTL定位，重复检测到一个稳定遗传的主效QTL定位在3号染色体上[26-32]。

2004年，Lee等[26]对大豆S-100(耐盐)与Tokyo(盐敏感)杂交后代分离群体F2:5分析和鉴定后发现，在大豆3号染色体上存在一个大豆苗期耐盐相关主效QTL，且该QTL在大田实验和温室鉴定可解释41%和60%的遗传变异。系谱追踪杂交后代发现，当分离后代的Sat_091和Satt237的基因型与亲本S-100相同时，通常具有较高耐盐性，当与亲本Tokyo相同时，通常对盐害敏感，这说明这两个标记与大豆耐盐性紧密相连，可以作为耐盐分子标记用于育种。Hamwieh等[28]利用耐盐野生大豆种JWS-156-1与盐敏感栽培大豆Jackson(PI548657)杂交，获得的225个F2后代分离群体，依据叶绿素含量(SPAD value)和盐害症状分级两个表型，进行QTL定位分析。结果发现，定位在大豆3号染色体上的QTL占耐盐总变异的68.7%，且该QTL和Lee等[26]定位到的相同。Hamwieh等[29]在两个重组自交系(FT-Abyara×C01，津豆6号×0197)中，共同检测到1个苗期耐盐的位于3号染色体上的主效QTL，贡献率分别为44.0%和47.1%。以上3篇研究报道中定位的耐盐QTL是一致的。最终，4篇研究报道[30-33]先后通过独立研究试验证明该QTL的耐盐性来自基因GmCHX1(Glysoja01g005509/Glyma03g32900)/GmSALT3/GmNcl。Qi等[33]重测序发现，与耐盐野生豆亲本W08相比，盐敏感型亲本C05的该基因在第三个外显子上有Ty1/copia型转座子插入，这导致GmCHX1的翻译提前终止，影响该基因功能的正常发挥。该基因内，转座子插入的现象在盐敏感的Wiliams82、C27、野生豆W06、W07、W08和W09中都有发生。在大豆毛状根和烟草BY-2细胞过表达GmCHX1，发现盐胁迫下，无论是转基因大豆毛状根的鲜重还是转基因烟草BY-2细胞的存活率都要高于对照的。而Guan等[30]则利用拟南芥原生质体证明GmSALT3定位于内质网上，编码钠/质子转运蛋白，在耐盐型亲本铁丰-8号中大量表达，在盐敏感型亲本中几乎不表达，同时在根中的表达量要远远高于地上部的表达量。

除了3号染色体以外，通过连锁分析发现的其他染色上的耐盐相关的QTL也多有报道。2008年，Chen等[27]利用来自Kefeng-1×Nannong1138-2的由184个F7∶11家系组成的重组自交系群体进行大豆苗期耐盐QTL定位，共定位到7个QTL分布在6个染色体上。除了在大豆3号染色体上检测到与Lee等[26]定位到的相同耐盐QTL以外，18号染色体上也定位到一个新的可能QTL，该QTL在2年中，不论是温室环境还是田间环境都重复定位到，位于SSR标记Sat_164和Sat_358之间，变异解释率分别为10.8%和17.9%。而在另一研究中，姜静涵[34]利用Peking×NY36-87(耐盐品种)得到的F2∶3分离群体共220个家系，研究发现后代分离群体的耐盐∶分离∶盐敏感数符合1∶2∶1的遗传分离比例，且发现耐盐相关QTL在18号染色体上，大小约240Kb。这说明野生豆NY36-87的耐盐性是由18号染色体上的单个基因控制，且该基因落在SSR标记18-7和18-8之间。Kan等[10]利用由184份F7:11组成的重组自交系，定位大豆芽期耐盐相关QTLs 11个，其中两个位于18号染色体上，同时在8号染色体上也定位到了一个耐盐显著相关的QTL，其紧密连锁标记Sat_162和Kan等[9]获得候选基因Glyma08g12400.1的距离为792 811 bp。以上报道中说明这些染色体上可能存在耐盐相关基因。而在2017年，Tuyen等[35]将耐盐栽培豆 Fiskeby III(PI 438471)与栽培大豆Williams 82(PI 518671，中度敏感)杂交获得的132个F2后代用于苗期耐盐相关研究，在3号染色体定位到已知主效QTL外，在13号染色体上也定位到了一个可能的耐盐相关QTL。

连锁分作图大多是初定位结果，对数量性状定位的精确性有限。而且构建作图为获得足够数量的群体，需要杂交、自交多代，耗时较长。由于构建QTL定位群体的过程是在不同组合的不同遗传背景下发生多样化的重组过程，因此，QTL定位具有杂交组合特异性，如果遗传背景和世代的发生改变，定位到的QTL也可能随之改变。

2.2 大豆耐盐性状的关联分析

全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)是由Risch等[36]在1996年首先提出，可以在全基因水平上对复杂性状的遗传变异进行关联分析[37]。与基于父母本变异的连锁分析相比，利用自然群体的全基因组关联分析有着更大程度的自然变异和遗传多样性，有利于精细定位和基因的发掘[38-39]。

自从Hansen 等[40]首次将GWAS运用到海甜菜上后，GWAS在拟南芥、水稻和玉米等模式植物中非生物胁迫耐受基因定位研究已有众多报道[41-43]，而关于大豆耐盐全基因组关联分析报道相对较少。2014年，Zhang等[12]使用135个SSR标记，对257份栽培豆芽期的耐盐与耐碱性进行上位性关联分析，最终在2年环境中，共检测到83个与环境互作的耐盐(NaCl)相关QTL和86个与环境互作的耐碱(Na2CO3)相关QTL，这些标记在20个连锁群上都有分布，而且在这些QTL附近发现了耐盐相关基因，该研究结果为大豆耐盐碱相关基因的精细定位、克隆和分子育种提供了有价值的基础参考。2015年，Kan等[9]使用1 142个SNP标记，对191份栽培豆芽期的耐盐性进行全基因组关联分析，检测到8个与耐盐指标显著关联SNP标记和13个可能的SNP标记，分别位于2、3、6、8、9、12、13、14、17和18号染色体上，利用大豆基因组信息，在拟南芥基因数据库中同源比对后获得9个可能候选基因，实时荧光定量PCR表明Glyma08g12400.1、Glyma08g09730.1、Glyma18g47140.1、Glyma09g00460.1和Glyma09g00490.3这5个候选基因在芽期响应盐胁迫。另外，Kan等[10]利用205个SSR标记和196份自然群体，进行大豆芽期耐盐性状的关联分析，检测到22个耐盐相关的SSRs，其中Satt201、BE475343、CSSR306、Satt664和Satt567与芽期2个耐盐指标显著相关，而Satt156和Satt636这2个SSR标记与3个芽期耐盐指标显著相关[10]。2017年，Zeng等[44]使用33 009个SNP标记，对283份栽培豆进行苗期耐盐全基因组关联分析，结果表明，两个耐盐指标，叶片氯离子含量和SPAD值都能够定位到的显著相关SNP共45个，它们分布在2、3、7、8、10、13、14、16和20号染色体上，其中有31个SNP定位在3号染色上，且与已报道的Glyma03g32900十分接近，这些SNP的变异解释率可能来自该基因。

近年来，得益于基因组测序成本的不断下降，各种表型统计方法的不断完善，GWAS已应用于植物复杂性状的研究，相信大豆耐盐相关研究工作也必定会因此方法的应用而快速发展。另外，以上连锁和关联作图研究报道结果表明，芽期和苗期耐盐相关性状的基因定位均检测到多个耐盐相关的位点，这也说明了大豆耐盐性状是复杂的数量性状，受多个耐盐基因控制。

2.3 大豆耐盐相关基因及其耐盐机制

大豆全基因组测序完成后，大豆耐盐相关基因功能研究工作进程加速，结合转录组水平和蛋白组水平，筛选响应盐胁迫的基因，再与其他植物中已知耐盐基因同源比对，再通过现代生物分子技术验证其功能已成为一种有效的策略[23]。植物耐盐是一个复杂的过程，在植物耐盐机制中研究较多的包括离子吸收转运与稳态、渗透调节作用、活性氧清除系统、盐胁迫信号传导途径及转录因子参与调控等方向。在盐胁迫中，植物体内过量积累的Na+和Cl-是造成离子毒害的主要原因，因此，本部分主要介绍Na+和Cl-的转运机制及其耐盐基因。

2.3.1 参与Na+转运系统的基因。一般来说，Na+的过量累积会对植物造成离子毒害，维持体内较低Na+含量成为植物存活下来的关键。在高等植物中，3种主要的Na+转运方式已被研究的较为透彻：(1)将Na+从根部排出到根际；(2)将Na+螯合到液泡；(3)卸载木质部中Na+。而在大豆中，参与到这3个转运系统的基因也有所报道。

盐超敏感信号途径(Salt overly sensitive signaling pathway,SOS)在拟南芥中被首次报道以后，众多研究证明SOS家族对于植物的耐盐性是必不可少的[45-48]。在大豆中，Nie等[49]在野生型和atsos1-1突变体拟南芥中异源表达GmSOS1，发现GmSOS1能够补偿atsos1-1突变体拟南芥的耐盐性，盐胁迫条件下的种子萌发率显著高于atsos1-1突变体的。而在2017年，Zhao等[50]发现，盐胁迫下，过表达GmSOS1的拟南芥转基因后代与野生型相比，叶片电解质渗漏较低，H2O2、O2-和丙二醛积累较少。结果说明，在拟南芥中过表达GmSOS1后，拟南芥对盐胁迫的耐受性相比野生型得到提高，间接证明GmSOS1与大豆耐盐性相关。

盐胁迫下，位于拟南芥液泡膜上的Na+/H+逆转运蛋白(ArabidopsisthalianaNA+/H+EXCHANGER1,AtNHX1)能够将Na+螯合到液泡中，从而维持胞液低Na+浓度状态，最终提高拟南芥的耐盐性[51]。而在大豆中，Li等人[16]从大豆cDNA克隆了Na+/H+逆转运蛋白GmNHX1，发现盐胁迫下，过表达GmNHX1，烟草BY-2细胞的线粒体完整性和细胞活力相比野生型细胞的会显著提高。进一步试验证明，转GmNHX1的BY-2细胞液泡中Na+浓度高于对照，说明盐胁迫下GmNHX1能够将多余的Na+螯合到液泡中，作者同时发现定位在液泡膜上的GmNHX1会被氯化钠、氯化钾、硝酸钠、硝酸钾、氯化锂、脱落酸(ABA)、聚乙二醇(PEG)和干旱等非生物胁迫诱导表达。此外，莲花中过表达GmNHX1在盐胁迫下，与野生型相比，Na+和K+含量降低，K+/Na+比值增加，盐耐受性提高[52]。周国安等[53]报道了另一个大豆Na+/H+逆向转运蛋白基因GmNHX2，与野生型植株相比,过表达GmNHX2的拟南芥植株在萌发和幼苗期的NaCl耐受性得到提高。高盐环境下，Na+/H+逆转运蛋白可以将多余的Na+螯合到液泡中，降低胞液中Na+浓度，进而减轻Na+大量累积而引起的离子毒害，最终增强大豆耐盐性。

与其他组织相比，植物叶片更易受到Na+毒害的影响，因此，为了尽可能降低叶片中Na+含量，在Na+从根运输到地上部的过程中，将木质部中的Na+卸载下来则成为有效耐盐机制。这种耐盐机制在拟南芥、水稻和小麦中都有报道，高亲和K+转运蛋白(high-affinity K+transporter,HKT)家族参与这一转运过程[54-56]。2011年、2014 年，Chen等[57-58]接连研究了大豆高亲和K+转运蛋白基因GmHKT1和GmHKT1;4，验证转GmHKT1;4烟草的耐盐性均得到提高，并猜测基因GmHKT1;4参与了Na+和K+的稳态。HKT家族功能在拟南芥和水稻的研究较为透彻，而在大豆中有关该家族的耐盐机理和机制报道相对较少，因此还需要更深入的研究。

上述报道表明，大豆的Na+转运系统和其它高等植物所拥有的类似，然而，这些Na+转运系统的具体机理还需要进一步的研究，同时，可能存在其它Na+转运途径还有待发掘。

2.3.2 参与Cl-转运系统的基因。盐胁迫下，植物的Na+稳态机制已被广泛研究。Cl-是植物生长必需的微量营养素并且参与稳定膜电位和调节细胞pH过程，当其大量积累时，会对植物产生离子毒害，影响植物的正常生长[59]。在大豆中，有研究报道称定位在液泡膜上的GmCLC1，其转运Cl-依赖于胞质pH，而在拟南芥和大豆毛状根中过表达GmCLC1后发现，盐胁迫下，地上部Cl-的浓度要显著低于对照[60-61]，这说明盐胁迫下，该基因能够将多余的Cl-排出体外。而Tuyen等[31]研究认为GmNcl可以通过参与调控Na+和K+的累积来调控大豆的耐盐性，同时还发现盐胁迫下，GmNcl能够降低Cl-总含量，因此作者猜测GmNcl是一个Na+、K+、Cl-共转运蛋白。Cl-的转运和解毒机制研究不像Na+转运机制那么透彻，在大豆中的研究相比其它作物的更少，因此，盐胁迫下，大豆如何转运Cl-和维持Cl-稳态成为需要解决的问题，许多研究工作还有待展开。

3 问题与展望

大豆耐盐性是多基因控制的复杂数量性状，目前大豆响应盐胁迫和耐盐机制等方面已经取得显著进展。借助于高密度分子图谱，连锁分析及GWAS 已成为定位大豆耐盐QTL、获得耐盐基因的有效手段。连锁分析能够有效定位到关键基因，然而其耗时较长，定位分辨率低，且群体后代遗传多样性有限，这大大限制了分子标记辅助育种的效率。而自然种质群体在长期进化中积累大量重组和突变信息，有着较高的变异度和丰富的遗传多样性，GWAS能够实现QTL的精细定位，直接定位到基因本身也成为可能[38,62]，然而群体结构[63-64]和连锁衰减距离(LD)[39]则会影响基因定位结果。借助迅猛发展的高通量测序技术，综合利用这两种方法将有利于高效、精确地发现大豆耐盐连锁标记及定位大豆耐盐基因，并有望直接运用到大豆耐盐分子育种中，最终提高栽培大豆耐盐性。另外，目前大豆耐盐研究主要集中在苗期阶段，据报道大豆不同生育阶段的耐盐机制不同[6]，在实际生产上大豆芽期耐盐性是直接决定盐土上能否保证全苗和壮苗以及提高产量的关键，因此大豆芽期耐盐可能成为今后大豆耐盐育种研究的一个重要方面。另一方面，得益于大豆基因组测序的完成和其它高等植物耐盐机制的研究，许多大豆耐盐相关候选基因被克隆并鉴定，然而局限于大豆转基因技术的不完善，大部分基因的功能尚未在大豆中得以验证，限制了其应用。进一步完善大豆转基因技术，不仅有助于验证大豆耐盐基因的功能，揭示大豆耐盐的分子机制，还有助于直接利用大豆耐盐基因资源，创建耐盐性优良的转基因大豆新品种。此外，许多植物如红树、碱蓬及圣柳等具有较强的耐盐性，在长期与盐胁迫的抗争过程中，必然进化出一套完善的耐盐机制和相对应的耐盐基因，我们可以用分子生物学的方法研究其耐盐机制，并应用到大豆耐盐育种进程中来。