2，4-噻唑烷二酮改善奶山羊对隐性乳房炎先天免疫力的研究

编译/伍佰鑫 雷 虹 何 芳 李 晟 王 慧

（湖南省畜牧兽医研究所）

乳房炎是乳房感染（通常是细菌）的炎症反应，对动物福利、生鲜乳的产量和质量产生不利的影响。为了增强奶山羊自身对隐性乳房炎的抵抗能力，美国和意大利的学者用2，4-噻唑烷二酮和链球菌对泌乳奶山羊进行科学试验，其研究方法、结果和结论值得中国奶山羊养殖者借鉴。

1 试验方法

从美国俄勒冈州图马洛山羊场采购24 头莎能奶山羊，年龄（5.1±0.6）岁、胎次（3.6±0.6）胎、泌乳天数（156±14）天、体重（68.1±7.6 ）kg、按1～5 分的体况评分标准为（1.6±0.5）分，生鲜乳的细菌分析为阴性。奶山羊随机分为4 组，每组1 个羊栏，每栏6 头。每天饲喂2 次精饲料（08:00和18:00），自由采食干草（大约50%的果园干草和50%的苜蓿干草）；挤奶期间添加150 g山羊精饲料。每天（08:00）用移动式挤奶机给奶山羊挤奶1 次，挤奶前后用0.5%碘酒浸洗乳头。

1.1 2，4-噻唑烷二酮处理

奶山羊在新环境适应1 周之后，安装带有延伸装置的颈静脉留置导管（少数在试验期间掉落，直接进行颈静脉注射），每天用10 mL肝素化生理盐水（2 IU/mL）冲洗2 次，用弹力绷带固定和隐藏，1 周后再更换成兽用绷带。在导管插入当天，12 头奶山羊（A组）每天12:00每头注射2，4-噻唑烷二酮8 mg/kg体重（溶于10 mL无菌生理盐水），此剂量是以前用于奶牛试验的2 倍；另外12 头奶山羊（B组）每天12:00每只注射10 mL生理盐水，试验期共20 天。

1.2 乳房炎处理组

试验1 周、上午挤奶之后，每组半数的奶山羊（A1组6 头、B1组6 头）每头每个乳房内（借助1 次性无菌导管）注入含有1.7 × 108个链球菌的10 mL无菌生理盐水，作为乳房炎试验组；剩余的（A2组6 头、B2组6 头）奶山羊每头每个乳房内只注入10 mL无菌生理盐水，作为乳房炎试验的对照组。注入时用湿毛巾清洁乳头末端，然后用70%酒精棉擦拭消毒。注入后向上充分按摩乳房大约20 s以便接种均匀。试验用的链球菌来源于1.5 mL无菌瓶（从1 头乳房炎母牛体内分离、用DNA技术确定细菌品系）。乳房注射后，A1组有2 头奶山羊体温超过41 ℃并停止产奶，终止试验，因此2，4-噻唑烷二酮乳房炎试验组只有4 头奶山羊。

1.3 细菌培养和体细胞数分析

采购奶山羊当天、乳房注入前3 天、进行乳房注入前（共3 次）均要采集奶样进行细菌分析。每次采样前，乳头均要进行碘酒浸洗、一次性纸巾擦干，乳头孔用70%酒精消毒，并丢弃首先挤出的奶，将大约1 mL奶样采集至1.5 mL无菌管中。所有样本立即覆盖冰块，在4 h内转移到实验室，进行血琼脂平板细菌培养。所有样本中（试验用的）的链球菌均呈阴性。对即将进行乳房注入之前的奶样进行体细胞数分析。

1.4 产奶量和乳成分分析

试验期每天记录产奶量。在奶山羊分组（分栏）前5 天、准备注射2，4-噻唑烷二酮的当天、注射乳房链球菌的当天、注射乳房后的第1、2、3、5、7、12天，用10 mL小瓶采集奶样，分析乳成分（体细胞数、乳糖、乳脂、乳蛋白）。用计算式[0.327×产奶量（kg）+12.95×脂肪量（kg）+7.65×蛋白质量（kg））]计算能量校正乳。

1.5 体温与称重

在注射乳房前、后的最初6 h中的每个小时、注射乳房后6～114 h内每个间隔大约8 h，用直肠温度计检测奶山羊的体温。试验期内奶山羊每周称重1 次并记录。

1.6 采血

在注射2，4-噻唑烷二酮的当天、注射链球菌前的2 天、注射链球菌后最初3 天的每一天（24 h、48 h、72 h）、注射链球菌后第6天和第12天，奶山羊上午饲喂前，用内含抗血凝剂（或肝素钠）的10 mL真空管和20号针头，从颈静脉采集血液样本。采集完毕后，内含肝素钠的样本管覆盖冰块，内含抗血凝剂的样本管室温保存（30 min），离心机离心，-20 ℃保存直至分析结束。

1.7 血液代谢产物与炎症标识

血浆和血清样品用冰块保护以分析以下参数，包括糖代谢参数、胆固醇、尿素（脲）、钙、镁、游离脂肪酸（NEFA）、三酰甘油（TG）、β-羟基丁酸（β-HBA）和视黄醇（维生素A）；炎症相关的参数包括白蛋白、亲血色球蛋白（结合珠蛋白）、血浆铜蓝蛋白、对氧磷酶、髓过氧物酶（绿过氧物酶）、总胆红素、总活性氧代谢产物（ROMt）、锌和α-生育酚（维生素E）；肝脏参数是γ-谷氨酰转肽酶（γGT）。

1.8 胰岛素分析

在注射2，4-噻唑烷二酮5 天后、注射链球菌3 天后，用商业性酶联免疫吸附测定套件（ELISA）检测胰岛素的浓度。胰岛素敏感性定量检查指数=1÷（log空腹血胰岛素μU/mL +log空腹葡萄糖mg/dL），校正的胰岛素敏感性定量检查指数=1÷（log空腹血胰岛素μ U/m L+l o g空腹葡萄糖mg/dL+log游离脂肪酸mmol/L）。

1.9 吞噬百分率测定

在链球菌注射前2 天和后1天，用一半数量的噬菌细胞检测试剂（德国），从100 μL肝素抗凝全血中分离白细胞的噬菌细胞容量，使用每个试剂一半的数量减少大约5%的吞噬作用。给DNA染色的有核细胞装上门控后，运用侧向散射和前向散射评定多形核白细胞PMN（或粒性白血球）的百分率，确定所有白细胞、PMN和单核细胞的吞噬百分率。

1.10 脂肪活检

在链球菌注射前1 天和后7天，通过活组织检查，在尾头交替侧采集皮下脂肪组织。将剪断的尾头区域充分擦洗干净，在切口区皮下注射2%利多卡因。用无菌钳和外科手术刀做4～5 cm切口，暴露并采集组织，然后缝合。将活组织放入无菌培养皿里，培养皿里有喷洒过核糖核酸酶的纱布，用无菌手术刀解剖结缔组织和大血管，借助一次性无菌注射器和无菌生理盐水洗涤组织，洗干净的组织切成3份，其中2 份放入2 mL离心管中，再放入有干冰的泡沫盒，送到实验室-80 ℃保存。另外1 份放入1.5 mL离心管中，内含10%中性缓冲液福尔马林，此份用于组织学分析。

1.11 乳腺上皮细胞分离

运用磁力分选，从50 mL羊奶中分离乳腺上皮细胞。奶样采集到50 mL无菌管中，立即放置冰块保存。大约1 h后，4 ℃离心（1 000×g）10 min以分离脂肪和颗粒细胞。细胞用10 mL无菌磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤2 次，4℃离心（500×g）5 min，细胞第2次洗涤前用小型自动细胞计数器计数。最后将颗粒重悬在500 μL的PBS和0.1%牛血清蛋白溶液中，再转移至1.5 mL离心管（用PBS和0.1%牛血清蛋白溶液预湿润）中，添加与皮尔斯（Pierce）蛋白银磁珠结合的上皮特异性标记黏液素抗体（1 μL有1.0×106个细胞）。样本在1 个摇动器里的冰块上培养30 min，细胞用PBS洗涤1 次，立即用自动分离器分离。分离的阳性和阴性细胞-80 ℃保存，直至提取核糖核酸（RNA）。对于5 个随机奶样，先测定酪蛋白κ表达和抗体阳性阴性细胞上的乳白蛋白，再在5 个阳性细胞和5 个阴性细胞上，进行乳腺上皮细胞富集的评价。总的来看，抗体显示有更多的乳腺特异基因酪蛋白k和（乳白蛋白+抗体）。

1.12 RNA分离和逆转录定量聚合酶链式反应

用核糖核酸（RNA）清洗与集中器提取RNA。先用高速搅拌机破碎脂肪组织，分光光度计给脂肪组织的RNA定量，生物分析仪器评定RNA的完整度是（4.0±2.0），变动幅度为1.0～9.0。在（美国）国家生物技术信息中心（NCBI）搜索山羊的特异序列。检测了6 个潜在的内部控制基因，即3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、核糖体蛋白S9、酪氨酸3-单加氧酶、色氨酸5-单加氧酶激活蛋白多肽、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、线粒体核糖体蛋白L39。运用除开线粒体核糖体蛋白L39之外的5 个内部控制基因，获得脂肪组织最可靠的归一化因子（V值=0.23）。鉴于靶转录与脂质合成有关、过氧化物酶体增生物γ 激活和炎症有关，因此测定了过氧化物酶体增生物γ的丰度、假定靶脂蛋白脂酶、脂肪酸合成酶。同时也测定了乙酰辅酶A羧化酶α的转录、固醇（甾酮）调节元件结合转录因子、肿瘤坏死因子α，还测定了抗体、白细胞介素8和趋化因子配体2。多聚酶链式反应条件如下：50 ℃、2 min；95 ℃、10 min；60 ℃、1 min后40 个循环的95 ℃、15 s。执行解离曲线（从60 ℃到95 ℃的梯度）检查扩增子质量，最终数据通过2 倍稀释的6 个点标准曲线获得。

1.13 脂肪组织学分析

保存在10%福尔马林中性缓冲液中的脂肪组织样本，浸入15%蔗糖磷酸盐缓冲溶液，再浸入30%蔗糖磷酸盐缓冲溶液，在-27 ℃切成15 μm的碎块。碎块用水漂洗30 s后在磷酸盐缓冲溶液中洗涤，然后在哈里斯苏木精溶液培养3 min，再用温水漂洗25 s，浸泡在曙红溶液中，用磷酸盐缓冲溶液漂洗1 min，在80%乙醇中洗涤1 min，最后浸入二甲苯10 s，置于载玻片上，在显微镜（10×）里成像。用CellProfiler 2.1.1软件分析脂肪细胞的大小。除测定脂肪细胞平均面积外，再测定脂肪细胞不同部位和直径的频率，以便估计新脂肪细胞（小尺寸）和大脂肪细胞的形成 。

2 研究结果

乳房注射后最初5 h内，所有处理组的奶山羊体温总体下降，但在紧接着的39 h（即第6h至第44h）内显著升高，尤其是链球菌处理组（A1和B1）。与其它组相比，未注射2，4-噻唑烷二酮但注射了链球菌的处理组（B1）趋向于维持更高的体温，直至注射后114 h（大约5 天）达到一个显著的较高值（40.6 ℃）。与其它组相比，注射2，4-噻唑烷二酮但没有注射链球菌的处理组（A2）有更加稳定和更低的体温。奶山羊体重不受任何处理的影响。

2.1 产奶量和乳成分

链球菌处理组（A1和B1）的体细胞数总体上显著高于其它组，但在注射之前无差异。在链球菌注射的前1 天和后2 天，A1和B1组的体细胞数增加的倍数（分别是13.9倍和11.3 倍）比A2和B2组增加的倍数（分别是1 倍和1.3 倍）多，差异显著。A1和B1组维持比其它2 个组较高的体细胞数直至试验结束。接受2，4-噻唑烷二酮注射的奶山羊，尤其是注射后最初2天期间的A2组（注射2，4-噻唑烷二酮但未注射链球菌）奶山羊，体细胞数总体上较低。尽管在第8天观察到显著的差异，但校正数据后发现，未注射2，4-噻唑烷二酮但注射链球菌的处理组（B1）体细胞数总体上比其它3 个组高。说明未注射2，4-噻唑烷二酮的奶山羊一旦感染细菌，体细胞数就会迅速升高。

试验奶山羊的基线产奶量是（1.12±0.35） 千克/天。链球菌处理组（A1和B1）的产奶量总体下降，A1组只有一只产奶量数值下降，但B1组所有羊只产奶量数值都下降。链球菌处理组（A1和B1）的乳蛋白率较高，可能是较高的体细胞数导致。2，4-噻唑烷二酮处理组（A1和A2）的乳糖率较高。虽然统计学上差异不显著，但未注射2，4-噻唑烷二酮但注射链球菌的处理组（B1）乳脂量数值较低。B1组的能量校正奶下降。其它乳成分参数不受影响。

2.2 血液代谢参数

葡萄糖浓度不受2，4-噻唑烷二酮的影响，但链球菌注射后葡萄糖浓度总体上较高（主要是由于B1组血糖浓度的大量增加），相反，A1组的葡萄糖浓度与A2和B2组相比无显著差异。除A2组外，其它组的游离脂肪酸总体上增加。与2，4-噻唑烷二酮处理组（A1、A2）相比，其它组（B1、B2）的游离脂肪酸浓度更加持续性增加，2，4-噻唑烷二酮处理组（A1、A2）的游离脂肪酸浓度总体上趋向更低。乳房注射后所有组的β-羟基丁酸浓度下降；乳房注射后的第12天，2，4-噻唑烷二酮处理组的β-羟基丁酸值总体上更低。三酰甘油的浓度不受影响，但链球菌处理组趋向更高（P=0.06）。乳房注射后第1天、第6天和第12天，A1组的尿素（脲）浓度比其它组高（P=0.09）。乳房注射后所有组的α-生育酚（维生素E）浓度都显著下降，但组与组之间无显著差异。2，4-噻唑烷二酮处理对血浆胰岛素水平和胰岛素敏感性定量检查指数无显著影响。

2.3 血液矿物质

A1和B1组链球菌注射前的钙增加，注射之后趋向于维持更高水平（主要因为A1组有更高浓度的钙）。A1和B1组的锌浓度趋向于比其它组的高（P=0.08），链球菌注射后总体上前期的比后期高；离注射前还有2 天和注射后第6天，A1组的锌浓度比其它组高；注射后第12天，A2组的锌浓度较高。注射后镁的水平下降，但组与组之间无显著差异。

2.4 炎症与肝脏应激

乳房注射前7 天内，阳性急性期结合珠蛋白+APP（多聚磷酸铵）的水平是（0.30±0.25） g/L；2，4-噻唑烷二酮处理1 周后，该蛋白水平总体上比B2组低，差异显著。链球菌注射后，所有组的结合珠蛋白水平快速上升（＞2 g/L），但A1、B1组总体上是持续更高水平（主要因为B1组）。所有组的血浆铜蓝蛋白，随着链球菌注射时间的推移而增加，A1、A2组对此无显著影响；但在试验结束时，A1、A2组比B2组的数值更低。

在标识上，2，4-噻唑烷二酮处理1 周后，A1和A2组的髓过氧化物酶（中性粒细胞吞噬力）总体上低于B2组，但链球菌注射后显著增加，一直到试验结束都比B2组的高；A2组的髓过氧物酶总体上比其它组高。链球菌注射前，组与组之间的肝脏应激参数γGT（γ-谷氨酰转肽酶）含量没有差异，但注射后A1和A2组总体上比B2组高（主要因为链球菌注射后第6天A2组的γGT含量增加）。

在阴性急性期反应指标之间，只有A1和A2组的白蛋白随时间变得更高。B1和B2组的总胆固醇含量下降，在链球菌处理后第6天显著低于A1和A2组。链球菌注射前2 天，A1组的视黄醇（维生素A）较高；在注射后第6天，B1组的视黄醇较低。在链球菌处理后，作为肝脏清除能力指数的阴性急性期蛋白、抗氧化剂对氧磷酶和总胆红素的活性都减少，不受2，4-噻唑烷二酮的影响。链球菌处理后，所有处理组总的活性氧代谢物增加，不受2，4-噻唑烷二酮的影响。

2.5 血液中的多形核白细胞和吞噬作用

乳房注射前，血液中的多形核白细胞百分率是（62.5±1.7）%，组与组之间无显著差异。乳房注射后，所有组的多形核白细胞浓度（%）都降低，链球菌处理组（A1和B1）的多形核白细胞浓度（%）比B2组（既没有2，4-噻唑烷二酮，又没有链球菌）的下降幅度大。所有粒性白细胞和多形核白细胞的吞噬作用（%）只受时间影响，不受2，4-噻唑烷二酮或链球菌的影响；单核细胞吞噬作用因链球菌注射而减少。

2.6 基因表达

乳房注射后，A1组的基因表达量总体上比其它组增加。链球菌处理显著影响黏蛋白（抗上皮特异性标志物的抗体）的基因表达，在链球菌注射后第1天较低；在第7天，A1和A2组的基因表达量比B2组高。链球菌诱导显著增加了CCL2的表达（CCL2是嗜中性粒细胞和巨噬细胞的化学引诱物）。PPARγ（过氧化物酶体增生物激活受体γ）的转录表达和它的靶基因都随时间增加或趋向于增加，2，4-噻唑烷二酮处理组的过氧化物酶体增生物激活受体的转录表达趋向于更高（P=0.08），尤其是在链球菌注射后的第1天。

2.7 脂肪细胞大小

脂肪细胞平均面积随时间显著增加（主要因为A2组）。链球菌处理前1天，2，4-噻唑烷二酮处理组（A1、A2）中等面积（3 000～5 000 μm2）脂肪细胞出现的频率总体上比B2组低。在注射后7 天内，A1、A2组小面积（1 500～3 000 μm2）脂肪细胞比B2组下降明显。注射前1天，A1、A2组中等直径（60～80 μm）脂肪细胞比B2组的低；大直径（＞100 μm）脂肪细胞趋向于更高。

3 研究结论

对于有隐性乳房炎的泌乳奶山羊，2，4-噻唑烷二酮处理后对产奶量、乳成分和总体代谢有相对适中的效果，可暂时降低胰岛素的敏感性；对炎症应答、体细胞和嗜中性粒细胞的功能有强烈效果；虽然对白细胞吞噬作用没有影响，但可增加嗜中性粒细胞的吞噬能力；可改善机体对乳房感染的回应。尽管2，4-噻唑烷二酮不会增加乳脂肪的合成，但可减弱因乳房感染导致乳脂肪合成的下降。2，4-噻唑烷二酮对基因转录没有或只有极小的影响。

原文：Fernanda R，Johan S O，Erminio T，et al. 2，4-Thiazolidinedione treatment improves the innate immune response in dairy goats with induced subclinical mastitis[J]，PPAR Research，2017：1-22.