蜈蚣败毒饮对银屑病转基因模型小鼠外周血中Th17细胞表达影响的研究

杨素清，安月鹏

（黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨 150040）

银屑病是临床上的常见病、疑难病，是一种由多基因遗传背景决定、T淋巴细胞介导的免疫性皮肤病。对于银屑病以往的发病机制研究主要局限于CD4+T细胞中的2大亚群Th1/Th2的细胞失衡理论。但随着近年来研究的不断深入，越来越多的证据表明[1]，银屑病的发生、发展与新型的CD4+T细胞亚群Th17细胞有着密切的关系，Th17细胞与其转导通路IL-23/IL-17对传统Th1/Th2细胞失衡理论起到了良好的补充作用，进一步的完善了银屑病的机制学研究。本研究以中药复方制剂蜈蚣败毒饮为观察药物，对其作用于银屑病转基因模型小鼠外周血中Th17细胞的表达情况进行随机对照研究，从新的角度揭示蜈蚣败毒饮的作用机制，为从中医“毒”、“瘀”理论辨治银屑病提供研究依据。

1 资料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器 流式细胞仪FACSCanto（美国BD公司）、CO2培养箱（德国Binder公司），手动移液器（美国Labnet Biopette公司）、电动移液器（美国Drummond公司）、生物安全柜（美国Labconco公司）。

1.1.2 试剂 无菌蒸馏水，戊巴比妥钠，肝素钠，固定破膜缓冲液，4%多聚甲醛，2%FBS PBS，Leukocyte ActivationCocktail，withBDGolgiPlugTM（BD200 μL），Fixation/Permeabilization Solution Kit（BD 250Test），CD4-FITC（BD 100 μg），IL-17A-PE（BD 100 μg）。

1.1.3 动物 转基因表达K5.Stat3C的银屑病模型小鼠[2]，共 25 只，体质量 180～220 g，均为雄性，转基因小鼠由南京大学—南京生物医药研究院制备。

1.2 方法

1.2.1 药液制备 中药制剂蜈蚣败毒饮由蜈蚣3 g、乌梢蛇 20 g、鬼箭羽 30 g、土茯苓 30 g、紫草 30 g、甘草10 g组成，草药来自于黑龙江中医药大学附属第一医院草药局，上述草药经常规煎煮2次，第1次煎煮前先加入8倍的水量浸泡4 h，再进行煎煮1 h；第2次煎煮时加入6倍的水量后直接进行煎煮，时间为1 h。最后将2次煎煮的药液进行混合均匀，分别浓缩成1.48、2.97、5.94 g/mL的蜈蚣败毒饮低、中、高剂量组，分别相当于成人常规用量的5倍、10倍、20倍。西药甲氨蝶呤片（国药准字H31020644，上海信谊药厂有限公司，规格2.5 mg/片），以15 mg的甲氨蝶呤溶于134.41 mL蒸馏水中，配制成浓度为0.11 g/L的甲氨蝶呤混悬液，相当于成人常规用量的10倍。

1.2.2 含药PBMC制备 采用随机的方法将K5.Stat3C转基因银屑病模型小鼠分为5组，每组5只，分别为蜈蚣败毒饮低剂量组、蜈蚣败毒饮中剂量组、蜈蚣败毒饮高剂量组、甲氨蝶呤西药对照组、生理盐水空白对照组。5组转基因小鼠的灌胃剂量均为2 mL/100（g·d），每日分早晚2次进行。蜈蚣败毒饮各剂量组、生理盐水空白对照组连续灌胃8 d；甲氨蝶呤西药对照组前4 d连续灌胃，后4 d以生理盐水进行灌胃，灌胃剂量及频次同前，如此符合甲氨蝶呤临床患者的药物服用方法。末次给药后1 h，各组转基因小鼠经戊巴比妥钠（35 mg/kg）腹腔注射麻醉，将小鼠固定在手术台上，在无菌的条件下经腹主动脉取血4 mL。抽取的血液于肝素钠真空采血管中，混匀，常温保存，并于2 h内提取PBMC供流式细胞学检测。

1.2.3 Ficoll密度梯度离心法分离PBMC 肝素钠抗凝全血1.5～2mL（同组小鼠血样合并）于1500转/min的室温离心6 min，血浆吸出分装于2 mL冻存管中，-80℃保存进行细胞因子检测。血细胞加入2倍体积的PBS后混匀。加入3 mL淋巴细胞分离液置离心管中，将稀释后的抗凝血贴壁加入离心管；淋巴细胞分离液与稀释后的血细胞体积比为1∶1。然后经2 000转/min室温不刹车离心20 min，吸取白膜层，为所需的PBMC细胞。白膜层用等量的PBS洗涤2次，以1 500转/（min·4℃）离心8 min，弃去上清。用1 mL RPMI1640重悬细胞沉淀，取10 μL用细胞计数板计数细胞数。

1.2.4 PBMC刺激培养 用10%FBS RPMI-1640稀释至PBMC终浓度0.5～1×106细胞/mL；于24孔板中加入1 mL细胞悬液，并加入2 μL PMA及离子霉素刺激剂（含Golgiplug），37℃孵育5 h。

1.2.5 细胞染色 各组细胞1 000转/min离心10 min，弃上清。加入500 μL 2%FBS PBS洗涤1次，1 000转/min离心10 min，弃上清。表面标记染色：加入10 μL 2%FBS PBS重悬细胞沉淀，将细胞分成2份，分别加入CD4-FITC抗体及IgG-FITC同型对照，4℃避光孵育30 min后，用500 μL 2%FBS PBS洗涤2次，弃上清。

1.2.6 破膜固定 加入250 μL固定破膜缓冲液，4℃孵育20 min，加入1 mL固定破膜洗涤液，洗涤2次。破膜固定后加入100 μL 4%多聚甲醛，4℃固定15 min，加入 500 μL 2%FBS PBS洗涤 2次后，加入500 μL 2%FBS PBS重悬细胞沉淀，4℃保存，72 h内进行胞内染色及检测。

1.2.7 胞内染色 加入50 μL固定破膜洗涤液重悬细胞沉淀，分别加入IL-17-PE抗体IgG-PE同型对照，4℃避光孵育30 min后，用1 mL固定破膜洗涤液洗涤2次，弃上清。加入500 μL 2%FBS PBS或4%多聚甲醛重悬细胞沉淀，流式上机检测。

1.2.8 流式细胞仪检测 将对照组流式样本先上机，调节电压及FITC和PE管设置补偿条件。将各实验组样本按上述条件于流式细胞仪上对PE+FITC管进行检测，其中每管共计数为20 000个细胞，从而测定 PE（+）、FITC（+）细胞的分布、PE 平均的荧光强度。

1.2.9 统计学处理 数据的处理采用SPSS 19.0统计学软件，其中计量资料采用均数±标准差（±s）的形式来表示，2组间的计量资料比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。组间比较检验前先进行正态性检验和方差齐性分析，若数据符合正态分布或方差齐性，则采用上述检验方法进行，反之则采用非参数检验进行数据分析。检验中α取双尾0.05，以P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

蜈蚣败毒饮对转基因实验小鼠外周血PBMC中Th17细胞表达率情况见表1及图1～5（对应流式细胞图中的Q4）。

表1 蜈蚣败毒饮对转基因小鼠外周血PBMC中Th17细胞表达率的影响

图1 空白对照组外周血Th17细胞表达

图2 甲氨蝶呤西药对照组外周血Th17细胞表达

图3 蜈蚣败毒饮低剂量组外周血Th17细胞表达

图4 蜈蚣败毒饮中剂量组外周血Th17细胞表达

图5 蜈蚣败毒饮高剂量组外周血Th17细胞表达

3 讨论

免疫学异常是银屑病发病机制的中心环节，银屑病的发生是由多细胞、多因子所介导的免疫异常性皮肤疾病，既往的研究主要集中于人体内Th细胞的Th0、Th1和Th2亚群，Th1/Th2漂移理论在银屑病的发病机制中占据主导地位，尤其是IL-2、IFN-γ、TNF-α等为代表的Th1细胞因子在银屑病的发病中最为重要，这些都说明了银屑病是发生了Th1/Th2漂移且以Th1反应模式为主，即偏向Th1漂移的免疫性疾病。Th17新型T细胞亚群的出现弥补了Th1/Th2效应机制的不足，同时将银屑病等诸多疾病的研究带入了新的世界[2-3]。研究发现，初始的T细胞可以在IL-6和TGF-β的协同诱导下，激活信号转导子和转录激活子，从而促进初始的CD4+T细胞向Th17细胞的分化，同时TGF-β亦可诱导T细胞IL-23受体的表达，使得Th17细胞对IL-23产生反应，而后使Th17细胞高表达IL-17，发生IL-23-Th-17-IL-17转导通路的链式反应，从而在银屑病患者皮损处可发现IL-17的表达[4]。越来越多的研究结果表明，Th17的这种细胞通路参与了银屑病疾病的发生和发展当中[5]。

蜈蚣败毒饮的理论依据于中医学的“毒”、“瘀”辨治体系[6-7]，在组方中融合了中医学祛风毒、清热毒、除湿毒、化瘀毒等的解毒化瘀之品，围绕疾病“病由毒生”和“久病必瘀”两大理论，针对疾病的发生和转归，创新性的提出了银屑病的“毒蕴瘀结”发病机制，在治疗上贯以“解毒消源，祛瘀截末，辅以防变”的辨治思想。既往研究主要围绕Th1/Th2漂移理论先后对 IL-2、IL-8、TNF-α、ET-1 等细胞因子进行了研究[8]，以及对HaCaT、HUVEC细胞的增殖和凋亡及其相关基因表达等方面进行了探索[9]，较为系统的对蜈蚣败毒饮的作用机制进行了分析，本研究再次针对于Th17细胞体系进行了初步血清学检测，对于Th1/Th2/Th17三大T细胞亚群的整体作用机制进行了良好的铺垫，为不断发现蜈蚣败毒饮等中医中药治疗机制方面的多靶点优势奠定了基础。

本研究采用了流式细胞术检测了银屑病转基因模型小鼠外周血PBMC的Th17细胞的表达情况。研究结果显示，甲氨蝶呤及蜈蚣败毒饮各剂量组均有降低外周血PBMC的Th17细胞表达的作用，其中尤以甲氨蝶呤西药对照组和蜈蚣败毒饮高剂量组的作用最为显著（P＜0.01），蜈蚣败毒饮各剂量组随着浓度的增高呈现出一定的量效依赖关系。研究结果初步揭示了蜈蚣败毒饮可以针对外周血PBMC中Th17细胞，影响Th17细胞的表达，从而推测对于银屑病的皮损具有相应的作用效应。本研究为后期研究提供了相应的保障，为今后蜈蚣败毒饮针对于Th17细胞体系中的某个具体环节或特异性因子的检测和分析提供了理论支持，同时，针对于Th17细胞机制和银屑病模型皮损严重程度的相关性研究亦是今后课题探索的思路和新的方向。

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