福清山羊地方性鼻内肿瘤病毒 绵羊肺炎支原体和溶血性曼氏杆菌混合感染的诊断病例

林裕胜,江锦秀,张靖鹏,游 伟,毛坤明,胡奇林

(1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建 福州 350013;2.福建省福清市畜牧兽医技术服务中心,福建 福清 350300)

2017年10月福清市某山羊养殖场发生了以流鼻涕、呼吸困难为主要特征的传染病,其中1～6月龄小羊病死率高达50%以上。通过临床症状、剖检病变和实验室检验,确诊为山羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus,ENTV)、绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)和溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,Mh)混合感染引起的山羊呼吸道疾病,诊断过程报告如下。

1 发病情况

福清市某农户共饲养的福清山羊127只,以山丘放牧为主。2017年5～6月份陆续出现6只1～8月龄左右山羊发病,表现为流鼻涕、咳嗽和呼吸困难,7月份出现20只3～6月龄山羊发病,主要表现为被毛粗乱,采食量减少、消瘦、流鼻涕、咳嗽,发病后期,羊鼻甲骨软化,用手按即可凹陷。到10月23日,已有32只山羊发病,主要以羔羊为主,2～6月龄羊发病28只,成年羊发病4只。这次疫情共发病32只,发病率为25.19%,17头出现死亡,死亡率为53.13%。该羊场发病早期已用青霉素、链霉素、氟苯尼考、头孢噻呋钠、板蓝根、鱼腥草等抗生素和中草药进行治疗,无明显好转。据了解该场使用过三联四防、口蹄疫疫苗、小反刍兽疫疫苗、传染性胸膜肺炎疫苗等进行免疫。

2 剖检病变

笔者对送检的3只病羊进行剖检,发现病羊的肺脏与肋骨粘连,肺部两侧边缘呈“肉变”,肺小叶间质增宽,其中1只腹腔内有少量积液;锯开头部,3只病羊左、右两侧鼻道内均可有灰白色息肉状物,表面光滑,呈透明状;其他脏器未见明显病变(见中插彩版图1、图2)。

3 实验室检验

3.1 细菌和支原体分离鉴定 取病死羊的鼻内容物、肺脏组织和腹腔渗出物,在血琼脂平板上划线进行病原菌的分离培养和纯化,于37℃的恒温培养24 h。同时对采集的鼻内容物和肺脏进行剪碎、研磨,加0.01 mol/L pH值7.2 PBS缓冲液制成10%匀浆,经离心后上清液进行支原体分离培养。并对病原菌的16S rRNA进行PCR扩增和测序。结果在平板上生长出针尖样大小、光滑的菌落。对分离菌16S rRNA序列PCR扩增结果显示,扩增出了目的片段,将分离菌的16S rRNA的序列在GenBank上进行比对,菌株与溶血性曼氏杆菌的同源性为100%,故分离菌为溶血性曼氏杆菌;支原体分离培养后经本研究室建立的三重PCR检测方法进行扩增,结果显示Mo阳性,Mmc和Mccp阴性,表明分离支原体为Mo。

3.2 病毒PCR检测 对采集的鼻内容物和肺脏进行剪碎、研磨,加0.01 mol/L pH值7.2 PBS缓冲液制成10%匀浆,利用生工组织和病毒RNA提取试剂盒提取研磨样品中的RNA,应用参考文献[1]建立羊口疮病毒和 ENTV PCR方法进行检测。PCR结果显示：ENTV的检测结果为阳性,羊口疮病毒检测结果为阴性。

4 诊断结果

根据临床症状、剖检病变、流行病学及实验室检验结果等综合判断,确诊该山羊养殖场山羊本次发病是由于ENTV、Mo和Mh混合感染所致。

5 讨论

山羊地方性鼻内肿瘤是由ENTV-2引起的一种慢性、进行性、接触性传染病,该病主要临床特征表现为食欲减退,呼吸困难,鼻漏,出现单侧或两侧性增生物;该病呈世界性分布,其发病率为0.5%～15%[3],致死率为100%。该羊场的发病率高达25.19%,且多以羔羊为主,比文献报道的发病率还要高。Mo是羊支原体性肺炎的主要病原之一,其临床症状表现为高热、咳嗽、喘气、渐进性消瘦、肺和胸膜发生浆液性和纤维素性炎症,病死率一般为30% ～50%,有的高达80% ～100%[4-5]。有文献报道绵羊肺炎支原体感染山羊后,会导致支气管上皮细胞严重损伤,使得溶血性曼氏杆菌、巴氏杆菌等细菌和病毒更容易侵入机体,造成混合感染。近年来Bessent、Rohana、李君璞均有报道绵羊肺炎支原体和溶血性曼氏杆菌混合感染的病例[6-8],未见 ENTV、Mo和 Mh同时感染山羊的报道。

在本次病例中,我们通过对病料进行细菌分离、PCR扩增和测序分析,成功分离到了1株Mh;通过支原体分离培养和PCR检测,分离到了1株Mo;通过参考文献合成引物对羊口疮病毒和ENTV进行PCR扩增,检测到了ENTV阳性;同时结合该病例临床上主要症状、剖检病变和流行病学等特点,确认该病例是由ENTV、Mo和Mh三种病原体混合感染所致。本病例表明引起山羊呼吸道疾病的病原体已经不单是支原体或者细菌的单一感染或者混合感染,已出现病毒、支原体和细菌三者混合感染的现象,使羊的疫病更加复杂化。

综上所述,ENTV、Mo和Mh可混合感染山羊引起严重的呼吸道疾病,对山羊养殖业形成严重威胁。因此,在山羊养殖过程中,除了注重防控口蹄疫、小反刍兽疫、山羊传染性胸膜肺炎等重大疫病外,还需注重对Mo、Mh和ENT的防控,因为这3种病原之间是哪一个是主要病原目前尚未有这方面的研究,并且国内外目前尚无ENT的有效疫苗和治疗药物,最有效的措施是净化,通过扑杀病羊及带毒羊的方法来控制该病。因此除了加强羊群的防疫工作,还应避免天气变化等因素造成的应激和免疫功能降低从而引起继发感染。