TLR4介导中药干预脑缺血炎症损伤的研究进展*

岳少乾，孙作艳，李 霖，张翕婷，朱金墙，张 晗

（天津中医药大学，天津 300193）

炎症反应是参与脑缺血损伤的重要病理机制，而缺血区恢复血流有加剧脑缺血损伤的风险，导致脑缺血区炎症反应的恶性循环。Toll样受体4（TLR4）在中枢神经系统内广泛表达，脑缺血损伤后多种内源性配体释放，激活TLR4，随后激活的TLR4通过信号级联传导，激活转录因子：核转录因子-κB（NF-κB）、激活剂蛋白-1（AP-1）、干扰素调节因子3（IRF3）从而产生多种炎症因子、Ⅰ型干扰素(IFN)，减轻或进一步加重缺血损伤[1]。近年研究表明,中药由于多成分、多途径、多靶点的作用特点，使其可以抑制TLR4转导途径中多个信号蛋白分子，从而有效抑制脑缺血损伤过程中的炎症反应。

1 TLR4简介

Toll样受体4（TLR4）是参与固有免疫反应的重要的模式识别受体蛋白，为Toll样受体（TLRs）家族中的基础成员，通过识别病原体相关分子模式配体（PAMPs）或损伤相关分子模式配体(DAMPs)并与之结合，从而触发机体的固有免疫应答机制。能够被TLR4识别的PAMPs包括来源于多种微生物（寄生虫、细菌、真菌、病毒）的致病体，如脂类、脂蛋白、蛋白质、和核酸等；而DAMPs主要包括机体损伤后自身释放的内源性分子，如高迁移率族蛋白B1（HMGB1）,热休克蛋白等[2-6]。

2 TLR4信号转导途径

TLR4信号转导途径可以分为髓样分化因子88（MyD88）依赖性和β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TRIF）依赖性信号通路。作为第一个被认定的TIR家族成员，MyD88被所有TLRs家族成员除ToLL校受体 3（TLR3）外所共有，并且通过激活 NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路而产生炎性细胞因子[7]。相反，TRIF仅作为TLR3、TLR4的募集蛋白，并且通过替代途径激活转录因子IRF3、NF-κB，随后产生Ⅰ型IFN和炎性细胞因子[5]。通过TLR4/NF-κB介导的炎症反应，需要MyD88和TRIF信号通路同时参与；而通过TLRs其他成员介导的炎症反应，只需要MyD88或者TRIF信号通路参与[3，5]，提示阻断TLR4的募集蛋白 MyD88，TLR4/NF-κB介导的炎症反应就会被抑制。

3 TLR4与脑缺血炎症损伤

脑缺血后，中枢神经系统产生的内源性配体以及外周产生通过血脑屏障进入中枢神经系统的内源性配体,被小胶质细胞膜表面的脂多糖受体CD14和TLR4受体识别并结合,小胶质细胞活化，随后转化为类似巨噬细胞形态和功能的特异性小胶质细胞，一方面释放细胞毒性（细胞因子、细胞黏附分子、趋化因子、一氧化氮、活性氧、前列腺素）或神经保护类细胞细胞因子（脑源性神经生长因子、促生长因子等），另一方面又能吞噬病变神经元，从而在中枢神经系统内发挥免疫活性[6，8-12]；同时，星型胶质细胞通过TLRs识别并结合内源性配体而被激活,分泌各种炎症因子包括：细胞因子、趋化因子、一氧化氮等[8]；两者释放的炎症因子随后又诱导内皮细胞分泌大量细胞黏附分子，导致血液中的中性粒细胞浸润于缺血区域脑组织，进一步激活胶质细胞。而神经元，一方面受胶质细胞释放的炎症因子的影响，加重自身损伤，另一方面又通过自身TLRs识别并结合内源性配体，释放多种炎症因子[8,12]。最终导致炎症反应的恶性循环，进一步加重脑缺血损伤。

4 中药调控TLR4信号转导途径减轻脑缺血炎症损伤

4.1 中药通过 TLR4/NF-κB途径减轻炎症反应 TLR4主要通过MyD88和TRIF途径激活NF-κB。一方面，MyD88 N末端死亡结构域白介素（IL）-1受体相关激酶（IRAK）家族成员之间的相互作用；IRAK4最先被激活，随后诱导IRAK1的磷酸化，磷酸化的IRAK4、IRAK1从MyD88内TIR结构域分离并且和E3泛素连接酶-肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）相互作用，被激活的TRAF6和E2、Ubc13、Uev1A共同促进TRAF6本身和NF-κB必需调节蛋白（NEMO）63位赖氨酸的泛素化；随后泛素化的TRAF6和NEMO募集蛋白激酶转化生长因子激活激酶1（TAK1）、转化生长因子激活激酶1结合蛋白（TAB）,最终 IκB 激酶（IKK）的 β 亚基被激活，使IκB-α32、36 和 IκB-β19、23 位丝氨酸 N-末端发生磷酸化，随后发生泛素化，最终降解并且暴露出P65的核定位序列，随即NF-κB在胞浆和细胞核穿梭的动态平衡被破坏，导致NF-κB主要集中在细胞核内，并与DNAκB序列结合，诱导包含κB序列的基因肿瘤坏死因子α（TNF-α）、细胞间黏附因子-1（ICAM-1）、环氧化酶 2（COX-2）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、白介素-6（IL-6）等的转录，同时新合成的IκB-α蛋白又和细胞核内的NF-κB结合，形成IκB/NF-κB复合物而恢复原来的动态平衡[3，13-15]。另一方面，TRIF通过其N末端区域内TRAF6结合序列直接与TRAF6结合，随后TRAF6以MyD88途径相似的方式激活TAK1；此外，TRIF又能够通过C末端区域内的受体反应蛋白（RIP）同型作用序列与RIP1相互作用，RIP1多泛素化后与TRAF6和TAK1形成复合物，最终导致NF-κB经典通路的激活[3，16]。

研究证实，中药复方如补阳还五汤[17]，中药有效成分如钩藤碱、氧化苦参碱、甘草甜素、紫草素、藁本内酯、葛根素、木犀草素、丹参酮ⅡA、黄连苷、薯蓣皂苷均能够通过TLR4/NF-κB途径减轻大脑中动脉阻塞（MCAO）模型中脑缺血损伤[17-28]。藁本内酯主要通过抑制TLR4内源性配体Prx6的释放抑制TLR4/NF-κB途径的激活，从而抑制炎症因子TNF-α、白介素-β（IL-1β）、ICAM-1、干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-17（IL-17）mRNA的表达和缺血区域胶质细胞活化和白细胞浸润，发挥神经保护作用。而薯蓣皂苷通过抑制HMGB-1的核移位抑制TLR4/MyD88/TRAF6/NF-κB途径的激活，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1、IFN-γ、巨噬细胞炎性蛋白-α（MIP-1α）、MIP-2、IL-17、IL-23mRNA 的表达，从而发挥其保护作用；随后通过培养PC12细胞和原代皮层神经元，结果相似，证明薯蓣皂苷潜在作用靶点在神经元。异槲皮素、黄芩苷均能在神经元氧糖剥夺/复氧（OGD/R）损伤条件下，通过 TLR4/NF-κB途径抑制神经元的炎症反应，从而发挥保护效应[29-30]。杨兴旺等[31]研究红花黄色素对小胶质细胞炎性反应通路的影响，发现可以通过抑制TLR4/NF-κB信号通路而发挥抗炎作用。

4.2 中药通过TLR4/AP-1途径减轻炎症反应 TLR4通过MyD88激活IKK，同时MAPK被激活；首先，胞外信号调节激酶（ERK）诱导高迁移率蛋白TCFs磷酸化，导致c-Fos表达增加，随后c-Fos和转录因子MEF2诱导c-Jun表达；由Fos蛋白中亮氨酸链构成的α螺旋结构和有相似结构的Jun蛋白构成的AP-1二聚体随之增加；胞内糖原合酶激酶-3β和核糖体S6激酶2大量存在时，使Fos蛋白和Jun蛋白发生磷酸化，最终AP-1被激活，移位入核与DNA上AP-1区域结合，调控一些炎症因子的表达，如：ICAM-1、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）[32-33]。

研究显示，木犀草素[24-25]、藁本内酯[22]、薯蓣皂苷[28]均能够通过TLR4/AP-1途径减轻中脑动脉闭塞（MCAO）模型中脑缺血损伤。木犀草素主要通过TLR4/ERK、P38途径发挥抗脑缺血损伤的作用。藁本内酯主要通过Prx6/TLR4/ERK途径发挥作用。薯蓣皂苷通过HMGB-1/TLR4/MyD88/TRAF6/MAPKs（ERK、JNK、P38）/AP-1途径发挥抗脑缺血损伤作用，随后体外培养神经元进行验证，发现结果相似。同样，异槲皮素也能在神经元OGD/R损伤条件下，通过TLR4/P-38、P-JNK、P-ERK途径抑制神经元的炎症反应[29]。4.3 中药通过TLR4/IRF3途径减轻炎症反应 TLR4通过TRIF依赖性途径激活IRF3，从而产生Ⅰ型IFN[3]。TLR4首先通过MyD88依赖性途径诱导早期NF-κB和MAPK活化，随后通过内吞途径传递到细胞囊泡内，与囊泡内TRAM和TRIF组成复合物，该复合物通过募集TRAF3和TANK结合激酶1（TBK1）和IKKi，催化IRF3磷酸化，形成IRF3二聚体，移位至细胞核，最终产生Ⅰ型IFN[34]。

Waleed等[20]研究甘草甜素对MCAO小鼠的保护作用时发现，甘草甜素可以抑制脑缺血导致的TLR4、TRIF、IRF3mRNA表达的升高，提示甘草甜素可以通过TLR4/TRIF/IRF3途径发挥抗脑缺血损伤的作用。

5 总结与展望

近些年，以TLR4为靶点治疗脑缺血损伤的研究备受研究者们的关注。笔者仅以TLR4在脑缺血损伤过程中的作用以及中药的干预作以上总结，旨在为减轻脑缺血损伤基于TLR4信号转导途径的抗炎疗法提供参考。

在TLRs家庭中，中药的作用靶点研究主要集中于TLR4，一方面，TLR4作为TLRs家族中的基础成员，TLR4介导的炎症反应几乎可以反映整个TLRs家族介导的炎症反应发生发展的过程；另一方面，TLR4介导的炎症反应，需要MyD88和TRIF信号通路共同参与，通过阻断MyD88 N末端死亡结构域IRAK蛋白激酶家族成员之间的信号传导，就可以抑制TLR4介导的炎症反应的整个过程；因此，以TLRs为作用靶点，研究中药抗脑缺血炎症损伤意义重大。

通过TLR4干预脑缺血损伤的中药有效成分主要包括：生物碱类、黄酮类、皂苷类、挥发油类。提示在今后以TLR4为靶点治疗脑缺血损伤的研究中可以主要从以上4类成分中筛选出中药活性成分。

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