青果氯仿萃取部位的化学成分研究Δ

杨洛萍，孟涵，谭穗懿，陈金香，段文军#（.南方医科大学药学院，广州5055；.南方医科大学中医药学院，广州 5055）

青果为芸香目橄榄科橄榄属植物橄榄（Canarium albumRaeusch.）的成熟果实，主要有清肺、利咽、生津、解毒的功效[1]。2015年版《中国药典》（一部）记载青果可治疗咽喉肿痛、烦渴、咳嗽吐血、菌痢、癫痫，可解河豚毒及酒毒[2-3]，为我国常用的清热、利咽的传统中药。其主要成分有多酚类、黄酮类、香豆素类、三萜类等[4-5]。本课题组前期试验中发现青果氯仿萃取部位具有体外抗人类免疫缺陷病毒（HIV）活性[6-7]，为进一步探究其抗HIV活性的物质基础，本研究对青果氯仿萃取部位的化学成分进行了系统分离鉴定，为明确青果抗HIV活性成分及探索抗艾滋病药物的先导化合物提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

Bruker AVANCEⅢ400型核磁共振仪（瑞士Bruker公司）；LC-16型液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；ZQ4000型液相色谱-质谱仪（美国Waters公司）；1290型超高效液相色谱-6230型飞行时间质谱仪（美国Agilent公司）。

1.2 试剂

聚酰胺填料（300～400目，上海江莱生物科技有限公司）；柱层析硅胶（200～300目，青岛海洋化工海洋公司）；小孔吸附树脂（MCI，75～150 μm，日本Mitubishi Chemical公司）；FUJI反相C18硅胶填料[40～75 μm，赛谱锐思（北京）科技有限公司]；Sephadex LH-20凝胶树脂（美国GE Healthcare公司）；Toyopearl HW-40F凝胶树脂（日本Tosoh公司）；薄层色谱硅胶板（青岛海洋化工厂）。

1.3 药材

青果购于广东省潮州市潮安县文祠镇下赤村果园，由南方医科大学中医药学院刘强教授鉴定为橄榄的成熟果实。

2 方法与结果

2.1 提取与分离

取青果50 kg，洗净后于65℃烘箱中干燥8 h，剥离果核后继续在55℃烘箱中干燥，得干燥的青果果肉4 kg。干燥果肉粉碎后用75%乙醇溶液回流提取3次，每次1.5 h，合并滤液后减压浓缩，得浸膏。浸膏用水分散，依次以氯仿、乙酸乙酯各萃取3～4次，水相与有机相体积比均为1∶1。回收有机溶剂，得氯仿萃取部位108 g，乙酸乙酯萃取部位86 g。将氯仿萃取部位加乙醇溶解，经聚酰胺层析柱，以乙醇-水（0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，V/V）梯度洗脱，经薄层色谱鉴别，富集浓缩，得4个流分（Fr.1～Fr.4）。

流分Fr.1（19 g）经MCI柱，以甲醇-水（0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2，V/V）梯度洗脱，得流分Fr.1-1～Fr.1-9。其中，Fr.1-4经Toyopearl HW-40F凝胶树脂柱与反相C18柱，以甲醇-水（0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶8、5∶5，V/V）梯度洗脱，经薄层色谱鉴别，富集浓缩，得化合物1（16 mg）和化合物2（3 mg）。

流分Fr.2（3.6 g）经MCI柱，以甲醇-水（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0，V/V）梯度洗脱，得流分Fr.2-1～Fr.2-10。将Fr.2-1、Fr.2-2经薄层色谱富集、浓缩、合并，经Sephadex LH-20凝胶树脂柱与Toyopearl HW-40F凝胶树脂柱，以甲醇-水（1∶9、2∶8、3∶7，V/V）梯度洗脱，经薄层色谱鉴别，富集浓缩，得化合物3（399 mg）。

流分Fr.3（4.4 g）经MCI柱，以甲醇-水（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2，V/V）梯度洗脱，得流分Fr.3-1～Fr.3-10。将Fr.3-1～Fr.3-3经薄层色谱富集、浓缩、合并，经Sephadex LH-20凝胶树脂柱，以甲醇-水（7∶3，V/V）等度洗脱，得化合物4（98 mg）；Fr.3-6经反相C18柱与Sephadex LH-20凝胶树脂柱，以甲醇-水（2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2，V/V）梯度洗脱，得化合物5（12 mg）和化合物6（8 mg）。

流分Fr.4（5.2 g）经MCI柱，以甲醇-水（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0，V/V）梯度洗脱，得流分Fr.4-1～Fr.4-10。将Fr.4-3～Fr.4-5经薄层色谱富集、浓缩、合并，经反相C18柱，以甲醇-水（5∶5，V/V）等度洗脱，得化合物7（13 mg）；Fr.4-7经Sephadex LH-20凝胶树脂柱与反相C18柱，以甲醇-水（2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2，V/V）梯度洗脱，得化合物8（305 mg）。

2.2 结构鉴定

化合物1：棕色粉末，易溶于水；紫外-可见光谱最大吸收波长（UVλmax）：266 nm；电喷雾电离质谱（ESI-MS）：质荷比（m/z）443[M-H]-；分子式：C21H32O10，分子量：444。1H-NMR（400 MHz，D2O）δ：7.66（1H，d，J＝16.0 Hz，H-4），6.44（1H，d，J＝16.0 Hz，H-5），5.77（1H，s，H-2），4.47（1H，d，J＝8 Hz，Glc H-1），4.22（1H，m，H-3′），3.85、3.66（2H，m，Glc H-6），3.80（1H，m，Glc H-2），3.38（1H，m，H-7′），3.38（1H，m，Glc H-3），3.29（1H，m，Glc H-4），3.13（1H，m，Glc H-5），2.16、1.96（2H，m，H-4′），2.01（3H，s，CH3-6），1.77（2H，m，H-2′），1.11（3H，s，CH3-9′），0.87（3H，s，CH3-10′）。13C-NMR（100 MHz，D2O）δ：170.28（C-1），151.27（C-3），133.12（C-5），130.54（C-4），117.72（C-2），101.07（Glc C-1），86.67（C-5′），82.47（C-8′），75.83（Glc C-3），75.71（C-7′），75.39（Glc C-2），73.48（C-3′），73.04（Glc C-5），69.54（Glc C-4），60.63（Glc C-6），47.79（C-1′），40.74（C-4′），40.57（C-2′），20.15（C-6），18.32（C-9′），14.98（C-10′）。与文献[8]的波谱数据基本一致，故可确定该化合物为二氢红花菜豆酸3′-O-β-D-葡萄糖苷（Dihydrophaseic acid-3′-O-β-D-glucopyranoside）。

化合物2：淡黄色粉末，易溶于水；FeCl3反应显蓝紫色；UVλmax：212、258、293 nm；ESI-MS：m/z153[M-H]-；分子式：C7H6O4，分子量：154。1H-NMR（400 MHz，D2O）δ：7.34（1H，d，J＝8.2 Hz，H-6），7.32（1H，s，H-2），6.80（1H，d，J＝8.2 Hz，H-5）。13C-NMR（100 MHz，D2O）δ：170.14（COOH），149.35（C-4），143.49（C-3），123.57（C-1），121.53（C-6），116.98（C-2），115.38（C-5）。与文献[9]的波谱数据基本一致，故可确定该化合物为3，4-二羟基苯甲酸（3，4-dihydroxybenzoic acid）。

化合物3：白色粉末，易溶于甲醇；FeCl3反应显蓝紫色；UVλmax：215、273 nm；高分辨飞行时间质谱（HR-TOFMS）：m/z345.082 8[M+H]+，343.047 6[M-H]-；分子式：C14H16O10，分子量：344。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.08（2H，s，Galloyl H），5.40（1H，m，H-3），4.21（1H，m，H-5），3.80（1H，dd，J＝7.9，2.9 Hz，H-4），2.24（2H，m，H-2），2.17（1H，m，H-6a），2.06（1H，dd，J＝13.8，6.0 Hz，H-6b）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：177.01（COOH），167.79（COO），146.39（C-3′，C-5′），139.80（C-4′），121.62（C-1′），110.24（C-2′，C-6′），75.88（C-1），73.10（C-3），72.26（C-4），70.94（C-5），38.34（C-2），38.10（C-6）。与文献[10]的波谱数据基本一致，故可确定该化合物为3-O-没食子酰奎尼酸（3-O-galloyl quinic acid）。

化合物4：白色粉末，易溶于甲醇；UVλmax：212、268 nm；ESI-MS：m/z169[M-H]-；分子式：C7H6O5，分子量：170。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.08（2H，s，H-2，H-6）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：168.98（COOH），144.93（C-3，C-5），138.12（C-4），120.57（C-1），108.88（C-2，C-6）。与文献[11]的波谱数据基本一致，故可确定该化合物为没食子酸（Gallic acid）。

化合物5：黄色粉末，易溶于甲醇；FeCl3反应显蓝紫色；UVλmax：214、272 nm；ESI-MS：m/z197[M-H]-；分子式：C9H10O5，分子量：198。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.05（2H，s，H-2，H-6），4.29（2H，q，J＝7.1 Hz，OCH2），1.36（3H，t，J＝7.1 Hz，CH3）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：167.08（C＝O），145.01（C-3，5），138.21（C-4），120.31（C-1），108.53（C-2，6），60.19（OCH2），13.17（CH3）。与文献[12]的波谱数据基本一致，故可确定该化合物为没食子酸乙酯（Ethyl gallate）。

化合物6：黄色晶体，易溶于甲醇；紫外灯下显蓝色荧光；ESI-MSm/z：215[M+Na]+；分子式：C10H8O4，分子量：192。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.86（1H，d，J＝9.4 Hz，H-4），7.12（1H，s，H-8），6.78（1H，s，H-5），6.22（1H，d，J＝9.4 Hz，H-3），3.92（3H，s，OCH3）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：162.58（C-2），151.45（C-7），149.95（C-9），145.61（C-6），144.64（C-4），111.14（C-3），111.08（C-10），108.47（C-5），102.49（C-8），55.34（OCH3）。与文献[13]的波谱数据基本一致，故可确定该化合物为东莨菪内酯（Scopoletin）。

化合物7：黄色结晶粉末，难溶于水、甲醇、氯仿；Fe-Cl3反应显蓝紫色；UVλmax：251、360 nm；HR-TOF-MSm/z：449.071 3[M+H]+，447.056 1[M-H]-；分子式：C20H16O12，分子量：448。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：7.74（1H，s，H-5），7.45（1H，s，H-5′），5.46（1H，s，Rha H-1），4.01（1H，m，Rha H-2），3.85（1H，dd，J＝9.4，3.4 Hz，Rha H-3），3.55（1H，m，Rha H-5），3.33（1H，t，J＝ 9.4 Hz，Rha H-4），1.14（3H，d，J＝6.2 Hz，Rha H-6）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：159.51（C-7），159.36（C-7′），149.14（C-4′），146.78（C-4），141.71（C-3），140.27（C-3′），137.09（C-2′），136.81（C-2），114.91（C-6），112.09（C-6′），111.98（C-5），110.68（C-5′），108.34（C-1），107.77（C-1′），100.58（Rha C-1），72.19（Rha C-4），70.49（Rha C-3），70.34（Rha C-5），70.29（Rha C-2），18.28（Rha C-6）。与文献[14]的波谱数据基本一致，故可确定该化合物为鞣花酸-4-O-α-L-吡喃鼠李糖苷（Ellagic acid-4-O-α-L-rhamnopyranoside）。

化合物8：淡黄色粉末，易溶于甲醇、丙酮；UVλmax：198、218、268 nm；HR-TOF-MSm/z：657.067 7[M+Na]+，633.038 7[M-H]-；分子式：C27H22O18，分子量：634。1HNMR（400 MHz，Acetone-d6）δ：7.14（1H，s，Gal H-2，6），6.85（1H，s，HHDP H-2），6.71（1H，s，HHDP H-2′），6.39（1H，d，J＝ 2.0 Hz，Glc H-1），4.97（1H，t，J＝10.9 Hz，Glc H-6a），4.84（1H，m，Glc H-3），4.53（1H，m，Glc H-5），4.47（1H，m，Glc H-4），4.12（1H，dd，J＝11，8.1 Hz，Glc H-6b），4.08（1H，d，J＝1.3 Hz，Glc H-2）。13C-NMR（100 MHz，Acetone-d6）δ：167.71（HHDP C′＝O），166.29（HHDP C＝O），164.25（Gal C＝O），144.96（Gal C-3，5），144.47（HHDP C-3，5），143.87（HHPP C3′），143.99（HHDP C5′），138.40（Gal C-4），136.28（HHDP C-4′），135.78（HHDP C-4），124.62（HHPP C-1），124.78（HHDP C-1′），119.85（Gal C-1），115.62（HHDP C-6′），114.96（HHDP C-6），109.87（Gal C-2，6），109.01（HHDP C-2），107.13（HHDP C-2′），93.26（Glc C-1），74.71（Glc C-5），69.74（Glc C-3），68.04（Glc C-2），63.42（Glc C-4），61.31（Glc C-6）。与文献[15]的波谱数据基本一致，故可确定该化合物为异柯里拉京（Isocorilagin）。

3 讨论

本研究首次青果氯仿提取部位的化学成分进行分离鉴定，共分离得到化合物1～8，分别为二氢红花菜豆酸3′-O-β-D-葡萄糖苷、3，4-二羟基苯甲酸、3-O-没食子酰奎尼酸、没食子酸、没食子酸乙酯、东莨菪内酯、鞣花酸-4-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、异柯里拉京。其中，化合物1、2、7为首次从青果中分离得到，而化合物8已由本课题组研究证实具有抗HIV的作用（行文待发）。据文献[16]报道，从苦味叶下珠（Phyllanthus amarus）的叶中分离的柯里拉京可以较强地抑制HIV在MT-4细胞中的复制，而从麻疯树（Jatropha curcas）和紫斑大戟（Chamaesyce hyssopifolia）中分离得到的柯里拉京可以体外抑制HIV逆转录酶[17]。本课题组分离到的异柯里拉京与柯里拉京结构上的差别只在于葡萄糖端基与没食子酸形成的苷键分别在β位与α位，故其可能具有抗HIV活性，但具体的抗病毒机制尚需深入研究。

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