黑曲霉液态发酵果胶酶及其对白水和纸浆中胶体物质控制

发明人：胡惠仁 赵晶 刘廷志 张正健

专利权人：天津科技大学

申请号：200810153643.4

授权公布号：CN 101418287 B

授权公告日：2010-12-08

权利要求书

1.一种黑曲霉液态发酵果胶酶制备方法，其特征在于：使用的生产菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期2008年11月25日，保藏号CGMCC No.2784，通过黑曲霉液态发酵产果胶酶，发酵步骤包括：

发酵方法：

（1）培养基的制备

摇瓶种子培养基：麸皮10～30 g/L；葡萄糖20～30 g/L；(NH4)2SO410～20 g/L；KH2PO41～3 g/L；Mg-SO4·7H2O 0.5～1 g/L，pH 4.0～6.0；

摇瓶发酵培养基：麸皮40～50 g/L；(NH4)2SO410～30 g/L；NaCl 1～4 g/L；MgSO4·7H2O 0.5～3 g/L；pH 4.0～6.0；

（2）发酵培养

将黑曲霉试管斜面菌种接入液体种子发酵罐中，在温度30℃、搅拌速度120 r/min、通风量0.2 m3/h的条件下发酵36～72 h，得到所需要的液体种子；然后按照3%～5%的接种量将种子接入黑曲霉发酵罐，在温度30～50℃、搅拌速度120 r/min、通风量0.2 m3/h的条件下发酵36～72 h，然后经过离心分离制得所需果胶酶液，并将其储存在果胶酶存储罐中以备用；

（3）果胶酶液提纯

用截留分子量10000的超滤膜对发酵液样品进行超滤浓缩至原体积的1/10～1/2后，收集浓缩粗酶液备用，进行硫酸铵分级沉淀预实验，确定硫酸铵分级沉淀的浓度为40%～100%，将粗酶液离心去除菌体，向上清液中加入硫酸铵至40%饱和度，4℃放置24 h，经4℃、8000 r/min离心10 min后，上清液继续加入硫酸铵至100%饱和度，4℃放置24 h，经4℃、8000 r/min离心30 min后，收集沉淀，将其溶于pH 6.0的乙酸-乙酸钠缓冲液中，用透析袋透析，得到提纯后的果胶酶液，果胶酶液的酶学性质为，最适反应温度30～60℃， 最适pH值4～6，30～60℃下保温2 h后剩余酶活高于90%。

2.一种采用权利要求1制备的果胶酶应用于处理造纸白水中溶解和胶体物质，其特征在于：加入果胶酶液至白水中，处理温度为30～60℃，处理时间20～60 min，所述白水为以机械浆和化学机械浆为主要浆料的造纸机白水，用于处理白水的果胶酶酶液的用量为15～50 U/100 mL白水。

3.一种采用权利要求1制备的果胶酶应用于控制纸浆中的溶解和胶体物质的方法，其特征在于：果胶酶添加入纸浆中，添加用量为3～10 U/g绝干浆，所述纸浆浆种为机械浆和化学机械浆。

技术领域

本发明涉及一种黑曲霉液态发酵果胶酶，尤其涉及应用于造纸白水和纸浆的黑曲霉液态发酵果胶酶。

背景技术

随着造纸白水循环回用技术的不断发展，目前造纸用水量已经有了很大程度的减少。但随着白水封闭循环程度的提高和循环次数的不断增加，白水中有害物质也会逐渐积累。在这些有害物质中，对抄纸和造纸湿部化学影响最大、最难处理的是白水中的称为“阴离子垃圾”的溶解和胶体物质（DCS）。胶体物质的不断富集，进而改变了电导率平衡，并增加阳离子需求。这些阴离子垃圾更易于与阳离子型的造纸助剂发生中和、吸附等作用，从而降低助剂的效果或失效。进而会导致湿纸页强度和抗张强度降低，纸机断头增多，运行性能降低。

传统的白水处理方法主要集中在对悬浮固体物（SS）的处理上，通过机械作用如圆盘过滤机、浮选和沉淀澄清器等，或进行生化处理，采用活性污泥或厌氧好氧生物反应器，但这些方法对废水中DCS的去除并不十分有效，只能作为一种初始处理措施。溶气浮选（dissolved air flotation，DAF）是目前新闻纸厂常用的水净化装置。DAF对于悬浮固体物质的去除是有效的，但对白水中DCS的去除效果并不好。

在现代造纸系统中，常采用化学方法对DCS进行控制。其中，减少造纸体系中阴离子垃圾的影响最有效的方法是用阴离子垃圾捕捉剂（ATC）或定着剂（fixative）对浆料进行预处理。但是，添加ATC时要严格控制用量，用量太少不能有效控制阴离子垃圾问题，用量太大会引起过阳离子化而影响后续纸页成型，影响助留助滤剂的添加效果，添加量应由溶解电荷和胶体表面电荷的滴定来确定。

对于未漂TMP浆，每吨浆中含有大约2 kg的溶解果胶。

有研究表明，漂白机械浆的溶解和胶体物质（DCS）物质主要产生在H2O2漂白过程中，果胶酸是漂白机械浆中DCS的阳离子需要量的重要贡献者。果胶是一种主要由半乳糖醛酸组成的多聚糖，脱甲基果胶一般称为聚半乳糖醛酸或果胶酸。在机械制浆的磨浆过程中，由于高温和高强度的机械作用，部分果胶质从纤维中游离出来。

果胶酶是分解果胶质的多种酶的总称，在食品加工、饲料加工、纺织、环境保护、诱导植物抗病等方面都有重大应用价值。微生物因具有生长速度快、生长条件简单、代谢过程特殊和分布广等特点而成为果胶酶的重要来源。近年来，不少学者把果胶酶应用于制浆造纸工业中。

美国专利5487172号披露了果胶酶处理可以降低热磨机械浆（TMP）中40%的阳离子需求。

Reid 等 在《Enzyme and Microbial Technology》2000年第26卷第2期115～123页“Pectinase in papermaking：Solving retentionproblems in mechanical pulps bleached with hydrogen peroxide”一文中报道了在工厂实验中，经过果胶酶处理的热磨机械浆（TMP）循环水的阳离子需求可降低28%～60%。

李宗全等在《中国造纸》2006年第25卷第8期23～26页“果胶酶处理BCTMP中DCS物质及其对阳离子助剂作用效果的影响”一文中的研究表明：果胶酶能够降解溶解物和胶体物质(DCS)中产生阴离子垃圾的主要物质果胶酸。DCS经果胶酶处理后，阳电荷需要量明显降低，与不用果胶酶处理相比，在相同阳离子助留剂加入量下，细小纤维的留着率明显提高。因此，使用果胶酶处理机械浆或造纸白水，可以减少其中的阴离子垃圾，降低阳离子聚合物的加入量，提高细小纤维的留着率。

但是，由于之前的学者均采用商品果胶酶处理，导致用果胶酶处理DCS物质成本偏高。因此，我国造纸界亟待开发以取代商品果胶酶的成本低的果胶酶，用以处理造纸白水和控制纸浆中的溶解和胶体物质（DCS）物质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黑曲霉液态发酵果胶酶的发酵工艺，通过此工艺发酵的果胶酶具有酶活高和良好热稳定性。

本发明的另一个目的在于提供一种将上述果胶酶应用于处理造纸白水和控制纸浆中的溶解和胶体物质的工艺，该工艺有效地降解白水中溶解和胶体物质和控制纸浆中的溶解和胶体物质，减少对阳离子的需求。

本发明为达到上述目的，所采用的技术方案：

一种黑曲霉液态发酵果胶酶，其特征在于使用的生产菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏日期2008年11月25日，保藏号CGMCC No.2784，通过黑曲霉液态发酵产果胶酶，其发酵步骤包括：

（1）培养基的制备

摇瓶种子培养基：麸皮 10～30 g/L；葡萄糖 20～30 g/L；(NH4)2SO410～20 g/L；KH2PO41～3 g/L；Mg-SO4·7H2O 0.5～1 g/L，pH 4.0～6.0；

摇瓶发酵培养基：麸皮40～50 g/L；(NH4)2SO410～30 g/L；NaCl 1～4 g/L；MgSO4·7H2O 0.5～3 g/L；pH 4.0～6.0 ；

（2）发酵方法

将黑曲霉试管斜面菌种接入液体种子发酵罐中，在温度30℃、搅拌速度120 r/min、通风量0.2 m3/h的条件下发酵36～72 h，得到所需要的液体种子；然后按照3%～5%的接种量将种子接入黑曲霉发酵罐，在温度30～50℃、搅拌速度120 r/min、通风量0.2 m3/h的条件下发酵36～72 h，然后经过离心分离制得所需果胶酶液，并将其储存在果胶酶存储罐中以备用；

（3）果胶酶液提纯

用截留分子量10000的超滤膜对发酵液样品进行超滤浓缩至原体积的1/10～1/2后，收集浓缩粗酶液备用，进行硫酸铵分级沉淀预实验，确定硫酸铵分级沉淀的浓度为40%～100%，将粗酶液离心去除菌体，向上清液中加入硫酸铵至40%饱和度，4℃放置24 h，经4℃、8000 r/min离心10 min后，上清液继续加入硫酸铵至100%饱和度，4℃放置24 h，经4℃、8000 r/min离心30 min后，收集沉淀，将其溶于pH 6.0的乙酸-乙酸钠缓冲液中，用透析袋透析，得到提纯后的果胶酶液，其酶学性质：最适反应温度为 30～60 ℃，最适 pH 值为 4～6，30～60 ℃下保温 2 h后剩余酶活高于90%。

采用本发明的制备方法制得的果胶酶酶液应用于处理造纸白水中溶解和胶体物质的方法，果胶酶处理溶解和胶体物质的工艺如下：

加入果胶酶液至白水中，处理温度为30～60℃，处理时间 20～60 min。

所述白水为以机械浆和化学机械浆为主要浆料的造纸机白水。

所述果胶酶用量为15～50 U/100mL白水。

采用本发明的制备方法制得的果胶酶应用于控制纸浆中溶解和胶体物质，将果胶酶添加于纸浆内，添加用量为3～10 U/g绝干浆，所述纸浆为机械浆和化学机械浆。

本发明的有益效果：

与传统的机械法和化学法处理白水以及用未加果胶酶液的白水做空白对照比较，本发明能有效地降解DCS物质中的果胶类物质，白水阳离子需求量(CD值)降低25%～30%，颗粒粒径减小，电导率增大。

本发明果胶酶液添加于纸浆内，对纸浆处理后，有效地降解了纸浆内的胶体物质。

具体实施方式

为了进一步了解本发明的内容、特点，下面用具体实施例说明本发明。

实施例

（1）液态发酵产果胶酶

将黑曲霉试管斜面菌种接入液体种子发酵罐中，种子发酵培养基采用：麸皮10 g/L，葡萄糖20 g/L，(NH4)2SO420 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，pH 4.0；在温度 30 ℃、pH 4.0、搅拌速度 120 r/min、通风量0.2 m3/h的条件下发酵48 h得到所需要的液体种子；然后按照3%的接种量将种子接入黑曲霉发酵罐，发酵培养基采用：麸皮 40 g/L；(NH4)2SO410 g/L；NaCl 1 g/L；MgSO4·7H2O 1 g/L；pH 4.0；在温度 30 ℃、pH 5、搅拌速度120r/min、通风量0.2 m3/h的条件下发酵72 h。过滤并离心发酵液，测量果胶酶酶活，吸光度达到0.725。

（2）果胶酶液的纯化

将粗酶液过滤离心后用截留分子量10000的膜对其进行超滤至原有体积的1/5。设定硫酸按浓度从0～100%，向酶液中加入硫酸铵粉末并进行有规则的搅拌，4℃放置24 h，观察并测定上清液中三种果胶酶的活力。结果表明粗果胶酶液中果胶酶的硫酸铵分级沉淀的浓度为50%～100%。

果胶酶液处理造纸白水中的溶解和胶体物质工艺：加入20U果胶酶液于盛有100 mL白水中，在40℃下处理40 min。

用未加果胶酶液的白水做空白对照例。与空白对照例比较，经过果胶酶液处理，白水处理后的阳离子需求量减少25%～30%，颗粒粒径减小，电导率增大果胶酶液应用于控制纸浆中胶体物质DCS的工艺：

将果胶酶液添加于纸浆内，添加用量为3～10 U/g绝干浆。所述纸浆为机械浆和化学机械浆，通过果胶酶对纸浆的处理，降解了纸浆内的胶体物质。

本发明具有处理工艺操作简单，成本低和易于控制等优点。