猪瘟病毒在宿主细胞中增殖与遗传变异的研究进展

孙骏翔，徐 璐，王 琴，张乾义

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)是有囊膜的单股正链RNA病毒，隶属于黄病毒科瘟病毒属。本属主要成员还包括牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)、边界病病毒(Border disease virus, BDV)等。瘟病毒不能在无脊椎动物体内增殖，而且所有成员不通过节肢动物传播[1]。瘟病毒在细胞浆内增殖并发育成熟。在宿主细胞中的增殖主要包括吸附宿主细胞及其内化、基因复制表达、病毒粒子的装配及释放等过程。而目前人们针对瘟病毒属在宿主体内增殖及遗传变异过程知之甚少，因此就瘟病毒属特别是猪瘟病毒的增殖过程及遗传变异情况进行了论述。

血清学实验证明，CSFV、BVDV和BDV之间在抗原上存在很大相似性，有很强的交叉反应，肯定了它们之间存在着很近的亲缘关系。人们在早期按照宿主动物的种类来区别瘟病毒，例如从牛中分离出的瘟病毒被命名为BVDV，而从猪中分离的则被称为CSFV。实际上这三种病毒能在彼此的易感宿主中传播，例如猪可以被BVDV或BDV自然感染，而在动物感染实验中BVDV能感染猪和羊，BDV能感染牛和猪。

1 病毒的增殖

1.1 病毒的吸附穿入及内化 OIE/国家猪瘟参考实验室应用可视化原位杂交技术(ViewRNA ISH)在体外细胞实验证明，CSFV在感染细胞0.5 h以内吸附进入靶细胞[2]。病毒吸附效率与环境pH有关，经过NH4Cl处理的细胞，CSFV感染效率会发生明显下降，说明CSFV建立感染的过程有可能依赖于酸性环境[3]。病毒的吸附内化是一个极其复杂的过程，除了与pH有关外，病毒蛋白及其受体同样发挥着重要作用。瘟病毒在吸附和穿入宿主细胞时，主要由Erns、E1、E2三种囊膜糖蛋白与宿主细胞受体蛋白之间相互作用介导的内吞来完成。囊膜蛋白的糖基化对病毒侵染细胞有重要作用，应用糖基化抑制剂抑制Erns、E1、E2三种囊膜糖蛋白的糖基合成和修饰，可以有效地降低病毒对宿主细胞的感染能力[4]。Erns蛋白的受体是硫酸乙酰肝素(HS)。Erns蛋白中相应氨基酸的改变导致其与HS结合能力的差异，从而引起不同病毒毒株在体内和体外感染宿主细胞的能力差异[5]。但Erns对于病毒吸附宿主细胞却不是必须的，有研究表明在一个以假病毒为载体的试验中，E1和E2即可满足病毒的穿入需要[6]，目前针对E2蛋白的受体尚无明确定论，免疫共沉淀试验证明猪瘟病毒E2蛋白能够沉淀PK15细胞表面的CD46分子[7]，说明CD46蛋白与猪瘟病毒E2蛋白之间存在相互作用，提示CD46蛋白可能是猪瘟病毒吸附过程中所必需的受体蛋白之一。

瘟病毒属同其他有囊膜病毒类似，也是通过胞吞作用进入靶细胞。以CSFV为例，CSFV通过囊膜蛋白与受体结合，再经包涵素依赖的受体介导的胞吞途径内化。糖蛋白与受体结合后，激活或者暴露其相应的内吞信号，内吞信号能介导它们进入包被小窝，随后胞膜局部磷脂组成改变，从而使胞膜弯曲。一旦包被小窝向内凹陷到一定程度，包被小窝从细胞膜处分离从而形成胞吞囊泡。胞吞囊泡进入细胞浆后，在突触小泡磷酸酶(Synaptojanin)、辅助蛋白(Auxilin)等蛋白共同作用下脱包被[8]，随后在包涵素等参与下与质膜附近的早期内吞体融合，内吞体中的酸性环境可以促使病毒的穿透，完成病毒的侵入过程。

1.2 病毒基因翻译与复制 病毒侵入宿主细胞后，CSFV基因组从核衣壳中释放后，单股正链RNA直接作为mRNA进行蛋白质翻译，翻译成一个由3,898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，经过蛋白酶作用，被裂解成4个结构蛋白(核心蛋白C、Erns、E1、E2)和8个非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。各蛋白的排列顺序从N端到C端依次为NH2-Npro-C-Erns-E1-E2-P7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH。现已明确了CSFV大部分基因片段的分子结构和功能。病毒蛋白与宿主蛋白相互作用，共同完成病毒的翻译与复制。

CSFV RNA复制是在细胞质膜上进行的，丝裂原激活的蛋白激酶激酶2(Mitogen-activated protein kinase kinase 2，MEK2)位于细胞质内，是细胞外信号调节激酶(Extracellular signaling-regulation kinase,ERK)信号通路的重要激酶，ERK信号通路可以与JAK-STAT信号通路相互调节发挥INF-α的抗病毒作用。MEK2与E2蛋白互作可以下调JAK-STAT的信号通路，进而增强CSFV的复制[9]。OIE/国家猪瘟参考实验室应用可视化原位杂交(ViewISH)技术对感染细胞中CSFV RNA的定位研究中发现，感染早期病毒RNA不仅存在于细胞浆，细胞核内也检测到病毒RNA的存在，提示宿主细胞核对病毒复制有着某种作用[10]。已有文献证明核不均一性核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonu-cleoprotein，hnRNPs)是存在于细胞核中的一类蛋白，参与病毒RNA的合成与加工。在CSFV感染诱导PK-15细胞蛋白质组研究中也发现细胞中有4种hnRNPs的表达水平发生变化[11]，表明CSFV的复制同样需要宿主细胞hnRNPs参与病毒RNA的合成与加工。NS3蛋白是核糖体切入位点结合蛋白，其RNA解旋酶活性可以增强核糖体切入位点内翻译和细胞翻译，是CSFV基因复制不可或缺的蛋白基因[12]。NSSB与NS3蛋白酶结构域作用既可以增强核糖体切入位点作用，也可以增强细胞的蛋白翻译水平。体外实验证实C蛋白可以促进由NS5B蛋白介导的RNA从头合成途径，且C蛋白与NS5B共表达可以增强NS5B蛋白的活性[13]。NS5B编码的RdRp(RNA依赖性RNA聚合酶)是病毒复制酶的主要成分，与其他病毒蛋白及宿主细胞中的一些蛋白因子共同构成病毒复制酶系统。CSFV的RdRp具有模板特异性，能复制病毒的RNA而不复制细胞的RNA。RdRp存在一段由12个氨基酸残基组成的β-loop结构，该结构可以调控RdRp准确的从病毒RNA 3'末端起始RNA合成。RdRp与CSFV正链RNA的3'NTR上的复制起始位点结合，在宿主蛋白和其他蛋白的帮助下，按照引物非依赖从头合成的机制，以正链RNA为模板起始病毒RNA的合成[14]。随着负链RNA的延长，RdRp沿着模板到达5'NTR内的复制起始识别位点，为合成第二条链做准备。由于5'末端存在发卡结构，RdRp到达5'末端后利用自身的核苷酸转移酶活性继续延长正在合成的RNA链，然后采用copy-back机制折返[15]，开始以负链为模板进行RNA的正链合成，连接处的单链部分随后被水解。

CSFV、BVDV的5'NTR无甲基化的帽子结构由360～386个核苷酸组成，有两个复杂的茎环结构和发卡结构[16]。CSFV的3'NTR含有起始RNA合成的启动子、增强子等顺式作用元件，因此在病毒复制中起着非常重要的调控作用。3'NTR的二级结构中，第一茎环及第一茎环和第二茎环之间的单链序列为复制起始的必需因子，其茎环结构的改变可以调节病毒RNA的复制效率。

1.3 病毒的装配与释放 新合成的病毒核酸和结构蛋白在感染细胞内组合成病毒颗粒的过程称为装配，而从细胞内转移到细胞外的过程为释放。病毒的装配是病毒复制增殖中的重要步骤，与大多数RNA病毒相似，CSFV的装配也是在细胞质中完成。对于单链RNA病毒来说，壳体是沿着基因组组装的，组装原则是RNA在壳体的位置直接由与之结合的外壳蛋白决定[17]。C蛋白是CSFV编码的第一个结构蛋白，它在合成后不久即与基因组RNA结合包装形成核衣壳。另外，C蛋白和宿主细胞骨架调控蛋白IQGPA1(IQ domain GTPase—activating protein1)发生作用决定病毒从宿主细胞中释放以及感染细胞过程中穿透细胞膜[18]。其余三个结构蛋白的二聚化可能在病毒装配中有着重要作用[19]。病毒囊膜蛋白在细胞中的分布与数量在很大程度上决定了病毒成熟的部位。CSFV的囊膜蛋白在C-Erns-E1-E2前体的基础上，由定位在宿主细胞内质网和高尔基体上的信号肽酶、蛋白水解酶以及糖基化酶的作用下加工成熟的，并被转运到内质网上。成熟的病毒粒子常见于细胞质中的无定型基质的囊膜中，有时还可看到囊膜在质膜处的开口以及周围的无定型基质和其中的成熟病毒,提示CSFV可能是通过这一特殊结构向外释放，且多数释放的病毒依然吸附在无定型基质中[20]。非结构蛋白也在CSFV的装配和释放中发挥作用，瘟病毒的P7蛋白是病毒孔蛋白家庭中的成员[21]，可以通过寡聚化在膜上形成一个亲水孔，进而调节跨膜阳离子的通透性，这对病毒的释放和成熟非常重要。与黄病毒和丙型肝炎病毒(HCV)相似，CSFV在完成出芽的过程中获得病毒包膜。CSFV在体外细胞培养下，发现新释放的病毒可以通过三种方式感染更多的细胞：一是感染细胞内释放的病毒粒子经过培养液感染新的易感细胞；二是被感染细胞通过有丝分裂直接传给子细胞，向培养液中加入抗猪瘟的抗血清不影响病毒感染滴度[22]；三是病毒通过细胞间桥在细胞之间传播[23]，或者外泌小体可以介导CSFV在细胞间的传递，从而开始新的病毒复制周期。

2 病毒的遗传变异

CSFV和BVDV的5'NTR是高度保守的[24]，而3'NTR则完全相反。CSFV、BVDV的5'NTR无甲基化的帽子结构有多个AUG密码子和一个核糖体结合位点，在病毒基因组复制及多聚蛋白表达中发挥重要的调控作用。不同CSFV毒株的5'NTR同源性较高，这有助于CSFV分子流行病学的调查和研究；同样，BVDV的5'UTR包含保守序列和高变序列，可以作为BVDV基因分型的依据[25]。陈锐等从基于5'NTR序列绘制的系统进化树分析西部散养肉牛BVDV，发现不同地区散养肉牛感染的BVDV基因亚型有所不同[26]。CSFV的3'NTR含有起始RNA合成的启动子、增强子等顺式作用元件，因此在病毒复制中起着非常重要的调控作用。比较猪瘟强毒株Shimen和疫苗株HCLV 的3'NTR二级结构后发现，疫苗株的3'NTR存在一个富含12bp的CTTTTTTCTTTT核苷酸结构，而强毒株3'NTR则没有这12个核苷酸的插入，研究表明，CSFV 3'NTR 插入12个核苷酸序列和病毒毒力的减弱有密切的关系[27]。这12个核苷酸的插入可能导致 3'NTR二级结构的不稳定性，从而影响病毒 RNA 的合成。CSFV 3'NTR的二级结构对毒复制和毒力有很大的影响，其二级结构包括4个茎环，按逆时针方向依次为茎环Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ[28]，茎环Ⅰ、Ⅱ较为稳定，Shimen株等强毒株的复制起始识别位点位于茎环Ⅰ区域的右侧，而C株复制起始的识别位点是在茎环Ⅰ顶端的两侧。茎环Ⅲ、Ⅳ位于3' NTR的高可变区，也是二级结构变化最大的区域，它的变化影响到病毒整个3'NTR的二级结构，从而进一步影响了CSFV RNA的复制。

病毒的变异主要源于其基因的突变和重组[29]，而瘟病毒属成员均为RNA病毒，没有RNA聚合酶的校对功能，因此病毒的变异率较高。已有报道证实我国存在同源重组的CSFV[30]。病毒一般通过重要抗原表位的变异，从而丧失与抗体的结合能力，导致毒株无法被机体免疫系统有效清除，造成持续感染。CSFV的 E2 蛋白可以诱导机体产生中和抗体从而有效对抗病毒感染，所以E2基因的变异可能导致CSFV 流行毒株的免疫逃逸。通过对CSFV石门株不同代次E2基因主要抗原编码区序列差异分析，证实CSFV在体内及体外具有一定的遗传稳定性，不因宿主免疫系统的选择压力而发生明显的遗传变异[31]。CSFV E2蛋白有15个保守Cys 位点，其中位于N端的6个Cys 通过形成3对二硫键对结构的正确折叠以及特异性抗原决定簇形成起着重要作用。李玲伟研究发现了一株CSFV突变株，其737位Cys突变为Arg，破坏B/C抗原区的空间结构，该突变株不能与部分对B/C抗原区的单克隆抗体反应，这一变异可能会影响疫苗的免疫效果[32]。E2基因是瘟病毒的主要保护性抗原编码基因，在瘟病毒结构蛋白基因中变异较大，代表着毒株的遗传特性。采用国际公认的利用E2基因序列进行分型可以将CSFV分为3个基因型，11个基因亚型，即1.1、1.2、1.3、1.4、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2、3.3和3.4亚型。Postel 等对欧洲33个CSFV分离毒株基因组5'-NTR-E2区段的约3580个核苷酸进行了分析，发现E2全长基因编码序列构建的进化树更具有统计学意义[33]，并利用E2全长分析，将以前E2基因片段系统进化分析鉴定的1.2亚型古巴CSFV流行毒株重新划分为基因1.4亚型[34]。本实验室通过对近年来各地样本检测并使用E2全基因序列分析发现，猪瘟在我国流行毒株已从2.1型、2.2型、1.1型，变为2.1型、1.1型，且2.1亚型分布更为广泛。

3 结 语

随着NS3、Npro、E2等病毒蛋白质功能的研究深入，人们对瘟病毒在体内增殖过程的研究有了一定的进展。而了解和监控病毒的变异动态，将为该病毒的防控或净化提供有力的理论和技术支撑。本文通过论述瘟病毒在细胞内增殖过程及病毒蛋白和宿主蛋白在病毒吸附及内化、基因复制表达、病毒粒子的装配及释放等过程中所发挥的作用，系统的阐述了瘟病毒在机体中的增殖特性及遗传变异。但依然有许多问题亟待解决，如瘟病毒的内化过程中需要的细胞受体、宿主细胞核是否在病毒复制过程中起作用、病毒装配后具体是如何释放到胞外等，人们对此依然知之甚少。近年来，得益于高通量测序的发展，采用文库筛选法来筛选病毒的特异细胞受体逐步为研究者所青睐。文库筛选法与免疫共沉淀等传统筛选受体方法相比具有高容量的特点，可涵盖全基因组，摆脱了传统方法仅能筛选高丰度细胞受体的局限性。相信随着科研人员对瘟病毒基础研究的进一步探索，不但可以为研究病毒与宿主间的相互作用提供思路，也为CSFV受体的互作蛋白研究提供科学的理论依据。

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