糖尿病肾病患者肾脏组织中尾加压素Ⅱ及转化生长因子β1的表达及意义

刘苑苹 李恒 包蓓艳 陈江华

糖尿病肾病是糖尿病常见的重要微血管并发症之一，是终末期肾病的主要原因之一，也是糖尿病患者致残、致死的重要原因。糖尿病肾病发病机制复杂，已有研究表明血流动力学因素、细胞因子因素在糖尿病肾病发生、发展中起重要作用。尾加压素Ⅱ（urotensinⅡ，UⅡ）是迄今发现体内作用最强的缩血管活性肽，其缩血管效应是内皮素-1的10倍多[1]，且UⅡ还是一种具有丝裂原样作用的生长因子，有刺激细胞增殖和促进细胞外基质表达等多种非血流动力学效应[2-3]。转化生长因子β1（TGF-β1）是一种多潜能的生长因子，由多种细胞分泌、具有多重生物学效应。近年来有研究提示UⅡ及TGF-β1与糖尿病肾病的发生、发展存在一定的关系[4-5]，但有关UⅡ在糖尿病肾病的表达规律迄今未见报道。笔者通过免疫组化法观察糖尿病肾病肾脏组织中UⅡ 和TGF-β1的表达，旨在探讨UⅡ和TGF-β1与糖尿病肾病病理及实验室检查指标之间的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2012年1月至2015年1月宁波市泌尿肾病医院行肾穿刺且病理诊断为糖尿病肾病的42例患者，排除合并恶性肿瘤及其他肾脏病（如原发性肾小球肾炎、药物性肾损伤等）。Tervaet等[6]标准病理指标定义：Ⅰ期：肾小球基底膜增厚，轻度或非特异性光镜改变；Ⅱ期：系膜增生；Ⅲ期：结节性硬化；Ⅳ期：球性废弃＞50%。根据Tervaet糖尿病肾病病理分型分为病变较轻组（糖尿病肾病Ⅰ期、Ⅱ期，A组）20例和病变较重组（糖尿病肾病Ⅲ期、Ⅳ期，B组）22例。A组男9例，女11 例，年龄 39～71（57.81±9.47） 岁；BMI 21.81～26.12（24.35±2.09）kg/m2；B 组男 12 例，女 10 例，年龄 45～75（59.90±7.97）岁；BMI 21.23～26.14（24.46±3.16）kg/m2。选自同期宁波市泌尿肾病医院泌尿外科住院手术患者15例作为对照组（C组），男9例，女6例，年龄39～77（57.47±10.41）岁；BMI 21.91～26.20（24.29±2.61）kg/m2，标本取自肾外伤破裂切除、肾肿瘤切除的肾组织（肾肿瘤切除组织需取远离肿瘤的肾组织），排除合并急慢性肾脏病、糖尿病、肉眼血尿的患者。3组患者性别、年龄、BMI的比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 主要试剂 人UⅡ试剂盒、人转化生长因子β1试剂盒均由美国Sigma公司生产。

1.3 标本采集 A、B组标本采集：肾组织均为经皮肾穿刺活检方法获得，穿刺部位选择左肾下极外侧缘。每例患者获得2条直径1.2mm，长约1.2cm肾组织，肾小球数不少于15个；尿液：肾穿刺前1d清晨留取晨尿；24h尿液：留取肾穿刺前1d至肾穿刺当日24h尿液，甲醛固定防腐；血液：肾穿刺当日清晨空腹抽血。C组标本采集：肾组织为手术时留取；尿液：手术前1d清晨留取晨尿；24h尿液：手术前1d至手术当日24h尿液，甲醛固定防腐；血液：手术当日清晨空腹抽血。肾组织标本均行常规病理检查。肾小球、肾小管间质及血管病变的各项病理参数，采用KatafuChi的半定量标准评分。

1.4 肾组织形态学观察和免疫组织化学检测 肾组织经4%中性甲醛固定48h，常规制备石蜡切片，应用免疫组织化学法检测各组肾组织中UⅡ、TGF-β1的表达情况。采用双盲法光镜观察，每张切片选取20个高倍镜（×200）视野下的肾小管区域，UⅡ、TGF-β1 采用半定量方法计数，以肾小管上皮细胞质染色棕褐色为UⅡ、TGF-β1表达阳性肾小管，通过每个视野下UⅡ、TGF-β1阳性肾小管占总肾小管的百分数评分，0分：无；1/2分：0～12.5%；1分：12.5%～25%；2分：25%～50%；3分：50%～75%；4分：75%～100%；最后以平均值表示。肾小球中UⅡ、TGF-β1的表达以15个肾小球中染色棕褐色为阳性肾小球细胞，最后以平均值表示。

1.5 观察指标 记录3组患者血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量、尿微量白蛋白、肾小球滤过率（eGFR），以及KatafuChi的半定量慢性化积分、总积分（半定量慢性化积分+半定量活动性积分）、UⅡ和TGF-β1在肾小球及肾小管的表达。

1.6 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件，计量资料用表示,组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Pearson相关、多元线性回归分析。

2 结果

2.1 3组患者血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量、尿微量白蛋白、eGFR、KatafuChi的半定量慢性化积分和总积分的比较 各组血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量、尿微量白蛋白、eGFR、KatafuChi的半定量慢性化积分、总积分差异均有统计学意义，糖尿病病变较重组显著高于其他两组（均P＜0.05），详见表1。

表1 3组患者血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量、尿微量白蛋白、eGFR、KatafuChi的半定量慢性化积分和总积分的比较

2.2 3组患者UⅡ、TGF-β1表达情况的比较 UⅡ、TGF-β1在C组肾小管的阳性表达均较低，在A、B组表达水平均明显增强，其中B组表达水平高于A组，各组间差异均有统计学意义（均P＜0.05）。UⅡ、TGF-β1在C组中肾小球只有极个别细胞阳性，在A组肾小球中阳性细胞数有所增加，而B组肾小球中阳性细胞数为各组中最多，各组间差异均有统计学意义（均P＜0.05），详见表2。

表2 3组患者UⅡ、TGF-β1表达情况的比较

2.3 UⅡ、TGF-β1之间与其他实验室检查指标的关系糖尿病患者中UⅡ在肾小球、肾小管的表达与TGF-β1的表达均呈正相关（r肾小球=0.950，r肾小管=0.963，均P＜0.01），与血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量、KatafuChi的半定量慢性化积分、总积分均呈正相关，与微量白蛋白正相关，与eGFR呈负相关。UⅡ、TGF-β1在肾小球、肾小管的表达与eGFR、半定量积分相关性最强，详见表3。分别以肾小球及肾小管U II及TGF-β1的表达为因变量，将血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量、尿微量白蛋白、eGFR、KatafuChi的半定量慢性化积分、总积分作为自变量，进行多元线性回归分析，发现存在共线性（VIF=16）。因本研究中eGFR通过血肌酐值计算而来，总积分包含慢性化积分，24h尿蛋白定量包含尿微量白蛋白；故将自变量中剔除血肌酐、尿微量白蛋白、慢性化积分剔除，再次行多元回归分析，结果显示：eGFR、总积分与因变量有显著相关性（T＞1，P＜0.05），而血尿素氮、24h尿蛋白定量相关性不显著。

表3 糖尿病患者UⅡ、TGF-β1在肾小球、肾小管的表达与血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量、eGFR、KatafuChi的半定量慢性化积分和总积分的相关性（r值）

3 讨论

糖尿病肾病的早期病理改变为肾小球肥大、基底膜增厚、细胞增生和细胞外基质（ECM）积聚。已有研究发现在糖尿病肾病模型大鼠的肾组织中，UⅡ水平的表达与肾小球平均体积及基底膜厚度的关系均呈正相关，表明UⅡ的过度表达与糖尿病肾病模型大鼠的肾脏病理的形态学改变密切相关[7]。

UⅡ对肾固有细胞具有很强的促有丝分裂作用。采用3H-TdR掺入法研究体外培养的大鼠肾系膜细胞，发现UⅡ能以浓度依赖式促进3H-TdR掺入增加，促进肾系膜细胞增殖，该效应与胞外Ca2+内流、钙调素激酶以及蛋白激酶C有关[8]。

UⅡ能够促进体外高糖培养的肾小球系膜细胞纤连蛋白、Ⅳ胶原mRNA的表达[9]。UⅡ同样能以剂量依赖式促进猪肾内皮细胞索3H-TdR掺入增加，使猪肾内皮细胞索的DNA合成及细胞数量增加，提示UⅡ表现出生长因子的活性[1]。本研究发现UⅡ表达在系膜增宽部位是增加的，KW形成区域明显增加。UⅡ表达与肾小球活动性积分呈正相关，说明UⅡ表达与系膜区细胞基质增生及细胞增殖密切相关。糖尿病肾病同样存在肾小管间质病变，肾小管间质病变可能在糖尿病肾病患者进展至终末期肾病中占据更主要的决定作用[11]。

TGF-β1是一个多潜能的生长因子，由多种细胞分泌的、具有多重生物学效应的细胞因子，产生相应的生物学效应，如趋化作用、有丝分裂原作用、促凋亡作用、促纤维化等[3、12]。TGF-β1主要分布在肾脏，其增多与组织纤维化之间存在因果关系，是公认的一种促纤维化因子，它不仅在间质表达，而且也存于在肾小管上皮细胞中，并可以诱导肾小管上皮细胞向间质转化[13]。

已有研究发现大鼠糖尿病组肾小管上皮细胞UⅡ与TGF-β1的表达水平呈正相关[2]。UⅡ能促进大鼠NRK-49F细胞增殖，影响细胞周期，可能与致纤维化因子TGF-β1的提高有关[14]。本研究发现TGF-β1的表达与肾小管间质病变积分呈正相关，本研究通过观察糖尿病肾病患者肾脏组织中UⅡ与TGF-β1的表达发现不管在肾小球还是在肾小管，两者表达均正相关（r肾小球=0.950，r肾小管=0.963，P＜0.01），说明两者之间存在密切的联系，两者可能存在协同作用，但两者之间作用机制尚不明确。

本研究发现UⅡ在正常对照组中的表达极少，在糖尿病肾病患者中表达明显增加，且在糖尿病病变较重组的表达明显高于糖尿病病变较轻组，而且UⅡ的表达与KatafuChi的半定量慢性化积分、总积分显著相关，说明UⅡ随着糖尿病肾病病情的加重表达是增加的，其能较好的评估糖尿病肾病的病变程度。UⅡ及TGF-β1的表达与血肌酐、eGFR、24h尿蛋白定量均有一定相关性，引入多元性回归分析后24h尿蛋白定量并无显著相关性，可能与糖尿病肾病进展到一定程度，肾小管间质损伤突出，尿蛋白并未进一步增加有关，说明肾组织中UⅡ及TGF-β1的表达比尿蛋白能更好的反应糖尿病肾病严重程度。多元性回归分析表明尿素氮与UⅡ及TGF-β1的表达并无明显相关性，考虑与患者肌肉含量、饮食等混杂因素有关。

最近有研究表明，UⅡ受体拮抗剂palosuran可增加胰岛素的释放并提高糖尿病大鼠的存活率，可以延缓糖尿病大鼠尿蛋白和肾脏损伤的发生[15]。故随着UⅡ生物学作用的进一步阐明,UⅡ可能成为肾脏疾病尤其是糖尿病肾病治疗的新靶点。

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