河南油田污染土壤生物联合修复技术研究

刘子菡 郝春雷

摘要：采用土著茵群、无机盐、向日葵进行了石油烃降解试验，结果表明：石油烃降解率达到了76.3%，土壤石油类含量由5621.6 mg/kg下降至1332.3 mg/kg，为石油烃污染土壤治理提供了生物联合修复的实验数据支撑，该技术是土壤环境治理技术的发展趋势。

关键词：油田;土壤污染;向日葵;石油烃降解菌;就地修复

中图分类号：X53

文献标识码：A

文章编号：1674-9944（2018）4-0117-04

1 引言

河南油田地处河南省西南部的南阳盆地，土壤类型为黄棕壤，是黄红壤与棕壤之间的过渡性土类，微酸性。河南油田产出原油为低硫石蜡基类稀油和沥青基类稠油，东部11个油田生产的原油，除3个稠油油田外，近80%的原油具有含蜡高、含硫低、凝固点高、轻质馏分比例低等特点。随着油田开采时间的延长，油水管线腐蚀穿孔、泄露造成的土壤污染，以及集油站、油水井井场等生产设备密集场所的土壤现状不容乐观，同时，关停井井场的土壤修复、复耕已迫在眉睫。如何高效地进行石油烃污染土壤的修复是摆在石油人面前的难题。

自然环境中的微生物极其丰富，当生存环境被污染后，微生物群落结构会发生变化，适应石油污染的种群继续发展或更好地发展，不适应石油污染的种群就会受到抑制最终被淘汰。土壤中石油烃的降解是混合菌共同作用的结果，通常不同的降解菌降解不同类型的石油烃分子，原油降解是由多种石油烃降解菌协同完成的[1]。在实际环境中，微生物种类繁多，作用复杂，它们根据需要构成一个特殊的生态群体[2]。大量研究表明，当菌群处于石油污染环境中时，利用烃类化合物的微生物数量急剧增长，在这个生态群体中，有些菌株虽然不能单独利用污染物，但是能利用中间代谢物生长，有的菌株拮抗其他菌株的降解，但是另一种菌株的存在又抵消了这种负作用，每一种菌在石油降解的过程中都有其用途[3]，因此，使用土著菌群而不是分离出单株菌株进行试验是一种有益的尝试。

在被污染的环境体系中，石油烃是微生物可以利用的大量碳底物，但它只能够提供有机碳而不能够提供其他营养物，因而氮、磷常常是限制微生物活性的重要因素[4]，为了使污染物完全降解，营养物是影响微生物降解的重要因素之一，有机和无机肥料的添加可在不同程度上提高石油烃的降解率;同时，土壤含氧量、含水率也对石油烃降解起到重要作用，地表植物的种植可以改善土壤含氧量与含水率状态，有利于菌群更好地生存，同时植物对有机物也有吸收降解作用，有研究表明向日葵能减少土壤中多环芳香烃的能力。因此，烃降解菌群、碳源、营养盐、含氧量、含水率、土壤有机质、植被等要素构成了一个系统，系统各要素之间协同作用，改善土壤污染状况。

2 研究方法

本研究利用土著石油烃降解菌群、无机营养盐、植物的共同作用进行石油烃污染土壤降解试验。首先，使用采自不同采油井场的土壤，富集土著微生物菌群，在实验室考察其在液态环境对石油烃的降解性能，选择具有较好降解效果的土著菌群，进行复壮扩培，投加到河南油田污染土壤中;其次，通过种植向日葵，记录其出芽率及植株生长情况以及烃降解率情况。

2.1 培养基的制备

（1）富集培养基：玉米浆干粉1.5 g，硝酸铵1.2 g，磷酸二氢钾1.2 g，蒸馏水600 mL，pH值为7.21，培养基120℃灭菌20 min。

（2）细菌培养基：牛肉膏4g，蛋白胨10 g，氯化钠5g，蒸馏水1000 mL，培养基120℃灭菌20 min。

（3）平板培养基：玉米浆干粉0.38 g，硝酸铵0.3 g，磷酸二氢钾0.3 g，蒸馏水150 mL，琼脂粉5g，pH值为7.23。培养基120℃灭菌20 min。

（4）石油烃降解菌培养基：玉米浆干粉1.5 g，磷酸二氢钾1.2 g，硝酸铵1.2 g，蒸馏水600 mL，pH值为7.02，培养基120℃灭菌20 min。碳源为正十二烷2 mL。

（5）培养皿的准备：为微生物计数用，准备直径90mm的培养皿数套。将培养皿清洗，在干热灭菌箱中灭菌2h，灭菌温度为250℃，冷却后取出待用。

2.2 微生物的富集

将20 g石油烃污染土壤加入100 mL富集培养基中（每个样品均做平行样，3个样品共6个培养基），置于250 mL锥形瓶中，使用脱脂棉将瓶口塞住，30℃、120 r/min摇床培养6d。待培养液浑浊，摇匀倒出80mL培养液，加入新鲜富集培养基80 mL，与上述培养条件相同转接富集培养5d。

2.3 微生物的发酵

将细菌发酵培养基30 mL装入100 mL锥形瓶中（每个富集培养基均做3个平行样品，共18个培养基），使用透气橡皮塞塞住瓶口，于120℃、20 min蒸汽灭菌，待压力降至0时取出冷却至45℃，在无菌试验台上将已浑浊的培养液分别在培养基液面上、中、下层吸取1 mL接转至细菌发酵培养基中，30℃、120 r/min摇床培养24 h。

2.4 石油烃降解菌群的培养

待细菌发酵培养液浑浊后，在100 mL锥形瓶中加入富集培养基30 mL，在无菌试验台上将已浑浊的细菌发酵培养液接转8 mL（菌液含量20%）至新培养基中，在每个锥形瓶中加入正十二烷2 mL（浓度5%），30℃、120 r/min摇床培养6d。

2.5 液态石油烃降解率与表面张力的测定

生物表面活性剂是微生物在一定条件下将某些物质转化为具有表面活性的物质，它具有表面活性剂的性质，即具有亲水、亲油性，有降低表面张力的能力，同时具有较好的生物降解性[5]，因此测定溶液的表面张力，可以验证石油烃降解菌的作用效果。表面张力测定使用ST-2000全自动界面张力仪，将培养液离心取上清液，将清液注入玻璃杯中，被测液体距杯口5～7 mm，按动升降按钮，待铂金环完全浸入液体后停止升降平台上升，按动升降按钮，随着玻璃平台下降，测定值不断变大，液膜被拉破，玻璃平台自动停止，自动显示出该液体的实际表面张力。每组样品的C号使用红外光度法进行石油烃降解率的测定，以验证石油烃降解菌在液態的降解效果。

2.6 菌落的计数

将表面张力最低的（石油烃降解效果最好的）3个取出，将灭菌的培养皿编号，从最大稀释度的稀释液中取1 mL稀释液，加到相应编号的培养皿中，样品加完后，将灭菌的培养基熔化并冷却到45℃左右，分别倒入相应的稀释平皿中，摇匀后，置于平台上，待培养基凝固后，将平皿倒置于25～28℃恒温箱中进行培养，培养24 h进行计数。

2.7 生物联合修复试验

取液态石油烃降解率最高的悬菌液，进行复壮，培养出的悬菌液在室外用花盆进行生物联合降解实验，供试植物选用向日葵，挑取一定量颗粒饱满的种子，播种前浸泡2h，取井场含油土壤样品混匀，分装在12个花盆内，每个花盆分装1000 mL，每组3个平行样，编号A土壤为空白，不添加菌液与营养盐，编号B为添加营养盐（硝酸铵0.2%，磷酸二氢钾0.2%）的含油土壤，编号C为添加菌液的含油土壤，编号D为添加菌液与营养盐的含油土壤，每个花盆中播种3粒向日葵种子，每组共9粒，保持盆土湿润，记录每组土壤样品的出芽时间、出芽率、植株高度、30 d石油烃降解率，生物联合修复试验具体流程见图1。

3 实验结果

微生物富集土壤样品采样地点选取魏岗油矿魏179井场、魏155井场、落地油污油池周边三个区域的石油污染土壤，生物联合修复实验的土壤为三处的混合土壤。采样点位选取在井口放空阀附近、原油最易污染的区域，距离地面5～10 cm处的土壤样品，石油烃含量最低5326.3 mg/kg，高于《农用污泥中污染物控制标准》（GB 4284-84）中污泥类含油污染物控制标准3000mg/kg（0.3%），土壤样品基本组成成分数据见表1。

3.1 表面张力

每组样品测定A、B两个石油烃降解菌培养液样品的表面张力，具体数据见表2。

采自魏179井场的1#样品表面张力值均低于采自魏155井场的2#样品与采自污油池周边的3#样品，最低为1# -2B达到了28.49 mN/m。说明采集的污染土壤样品中的菌种均能产生表面活性剂，且魏179井场的土壤表面张力最低，而生物表面活性剂同时具有较好的生物降解性，魏179井场土壤的菌群有较好的石油烃降解性能。

3.2 菌落计数

取每组样品表面张力较低的1# -2B、2#-1A、3#-2B使用平板涂布法进行菌落计数，菌落计数情况见表3。

菌数最高的为污油池周边污染土壤样品3# -2B，其次为魏179井场土壤样品1# -2B，说明污油池周边及魏179井场污染土壤的菌种具有更好的繁殖能力，能被大量富集培养。

3.3 液态石油烃降解率

将液态石油烃培养基在摇床培养6d的悬菌液用四氯化碳为萃取液，使用红外分光光度法测定石油烃含量，最后通过式（1）计算出各菌群的石油降解率，具体数据见图2。

石油降解率（%）=初始石油浓度Co -测定石油逍度C×100%

（1）

初始石油浓度Co

由图2可知，其中降解率最高的魏179井场土壤样品1# -2C、1#-1C降解率达到了56.9%、51.9%，其次为污油池周边土壤3# -2C降解率为47.1%，说明魏179井场富集培养的菌群具有较好的石油烃降解能力。

3.4 生物联合修复实验结果

取液态石油烃降解率最高的魏179井场土壤（1#-2）悬菌液，进行生物联合修复实验，花盆放置在室外露天处，使用晾晒自来水保持土壤湿润，第3dA组出芽率33%，其余各组出芽率89%，第5dA组出芽率67%，B组89%，其余2组100%，第7dA组出芽率78%，B组89%，其余2组100%。见图3。

30 d后将向日葵苗移出，每组3个盆土混合均匀，取适量样品测定土壤石油类含量，其中D组样品的土壤石油类含量降至1332.3 mg/kg，降解率达到76.3%，具体数据见表4。

由表4看出，A组未添加菌液与营养盐，3d出芽率明显滞后，出芽率仅33%，其余各组土壤出芽率达到了89%，而添加菌液的C、D组5 d出芽率就达到100%;说明向日葵种子的萌发明显受到石油烃污染的抑制，经微生物降解后，含油土壤更适合向日葵的生长。30 d植株生长情况：A、B组最低的植株仅7 cm，3对叶片，而C、D组植株高度均匀，最低也达到15 cm，5对叶片，且A、B组由于出芽率较低，每盆植株平均2株，3株的就有1株特别矮小，而C、D组每盆3株长势均匀，说明菌液的添加对向日葵的生长有明显促进，对土壤毒性降低效果明显。

30 d检测各土壤的石油类含量，添加悬菌液与无机营养盐的D样品降解率最高，石油烃降解率达到了76.3%，土壤石油类含量由5621.6mg/kg下降至1332.3mg/kg，較单独种植向日葵的A组土壤，降解率提高了59.1%;同时，未添加烃降解菌群的B组样品石油烃降解率23.6%，而生物联合修复的D组样品，石油烃降解率提高到76.3%，提高了52.7%，说明石油烃降解菌在土壤修复中起到至关重要的作用;未添加无机营养盐的C组样品石油烃降解率57.5%，较添加营养盐的D组样品低了18.8%，说明添加适量的氮、磷营养盐能使提高石油烃降解率。

4 结语

本研究将生物联合修复石油烃污染土壤作为一个系统，针对河南油田原油、土壤的特性，在采油井生产场所取样，富集、筛选高效土著石油烃降解菌群，与向日葵共同进行就地生物联合修复试验，30 d石油烃降解率达到了76.3%;生物联合修复主要集中在亚表层土壤的生态优化，将土壤、植物、微生物组成的复合体系看成一个完整的系统来共同降解污染物起到了事半功倍的效果，植物通过光合作用为微生物提供氧气，使土著微生物对污染物质进行最大程度的生物降解，微生物与植物共存，植物为微生物提供了生存场所，并可转移氧气使根区的好氧作用能够正常进行;同时根系的分泌物、脱落物可为微生物提供大量营养，刺激根际各种菌群的生长繁殖，增强细菌的联合降解作用;此外，植物根系可以伸展到不同层系的土壤中，故无需混合土壤即可使降解菌分散在土壤中;另一方面，微生物使污染物转化成植物可以吸收利用的状态，减轻了污染物对植物的毒性，提高了植物的耐受性，通过两者的互利作用，弥补单一修复方式的不足，大大提高了石油烃降解效果，为黄棕壤石油烃污染治理提供了生物联合就地修复的实验数据支撑，该修复技术耗能低，环境友好，是目前生物土壤环境治理技术的发展趋势。

致谢：本实验得以顺利完成要衷心感谢中国石油化工股份有限公司河南油田分公司工程技术研究院微生物研究所与河南油田勘探局环境监测站的技术人员，在仪器设备、技术指导、数据分析上提供了大力的支持，特此致谢。

参考文献：

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[2]张杰，刘永生，孟玲，等，多环芳烃降解菌筛选及其降解特性[J].应用生态学报.2003，14 （10）：17 83～1786.

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[4]金樑，顾宗濂.石油污染土壤及地下水的生物修复进展[J].应用与环境生物学报，1999（5）：130～135.

[5]李颖，贾丽娜，张鹏，高效生物修复菌株的筛选及其降解能力的研究[J].化工环保，2004，24（增刊）：15～17.