“肺气虚外感”大鼠模型的实验研究

贺前松，马 萍，陈 瑶

随着中医药研究的逐步规范，动物模型的建立已成为评价实验研究科学性的关键环节之一，“肺气虚外感”证型模型作为诸多慢性肺系疾病的主要研究对象，其构建方法已有多年历史并且相对成熟。经典的造模方法主要是“烟熏+冷风+LPS（脂多糖）”，主要模拟了人体长期处于空气污染的大环境以及风寒等外界刺激造成的肺气虚和以LPS为代表的细菌或外感因素。而经典方法中，LPS注射环节过程多为有创性，对大鼠呼吸道具有一定的机械损伤，且极易引起术后伤口感染致死，是“肺气虚外感”证型模型构建过程中比较难攻克的一个关卡。本研究中采用改良后经口气管注射LPS的方式，拟以此减轻对大鼠呼吸道的机械损伤，降低感染率，更好地模拟肺气虚外感的病理生理演变过程，并为后续实验提供更充足地动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠80只，雄性，8 w龄，体重（200±20）g，购自成都达硕实验动物有限公司[许可证号：SCXK(川）2015-030)]。

1.2 主要试剂与设备 黄河天下秀香烟（焦油量9 mg、烟气烟碱量0.9 mg、烟气一氧化碳量9 mg）购于川渝中烟工业有限责任公司；脂多糖、水合氯醛、PBS溶液、多聚甲醛（EM 级）、无水乙醇（AR 级）、二甲苯（AR级）、苏木素染液、伊红染液、中性树胶、TO型透明液，均购于合肥博美生物科技有限责任公司。

转轮式切片机购于德国徕卡，TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机、BMJ-Ⅲ型包埋机、PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪购于常州市中威电子仪器有限公司；BA400Digital数码三目摄像显微镜、Motic Images Advanced图像分析软件购于麦克奥迪实业集团有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组 实验大鼠购入后称重，适应性喂养3 d后，随机分为正常组和模型组，每组10只。正常组于正常饲养环境中自由进食进水喂养，期间记录大鼠一般情况。

1.3.2 “肺气虚外感”模型的建立 参照文献[1-3]的方法，将模型组大鼠置于自制熏箱中，自由进食进水，每天两次点燃香烟后连续烟熏30 min，中间间隔20 min避免窒息。烟熏后，采用风扇制冷风吹刺激1 h。于第15 d称重后，水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，然后将其捆绑在自制鼠板上，将大鼠头朝下呈约30°斜面；用镊子将鼠舌夹出口腔外，用6 cm小鼠灌胃针仔细寻找气管口：针头到达大鼠咽喉部后，稍往上抬避免插入食管，感觉阻力后进入，上下轻轻推移灌胃针，另一手在大鼠颈部正中摸到气管软骨结构随灌胃针上下浮动时，注入1 mg/ml LPS溶液，0.1 ml/只。迅速松解大鼠，并左右摇晃使LPS均匀分布于大鼠呼吸道内，等待麻醉结束。注射当天密切关注大鼠活动，LPS注射后第2 d起，按上方继续烟熏+冷风刺激6 d。

1.3.3 标本取材 于注射LPS后第7 d(造模结束)，所有大鼠麻醉后脱颈处死，取肺脏、胸腺、脾脏，PBS洗净擦干后称重。分别取各组大鼠右肺中叶包被于消毒干棉球中（避免组织含气量太大上浮于液体表面而固定不完全），置于4%多聚甲醛溶液保存。

1.3.4 病理切片制作 取多聚甲醛充分固定后肺组织，按浓度递增顺序进行乙醇脱水处理，期间注意勿在高浓度乙醇溶液中浸泡过久，以防组织变脆，破坏组织结构。脱水后，将肺组织置于TO透明剂中，充分透明后，将标本置于混合蜡中进行包埋，包埋块常温储存备用。

将包埋组织块进行切片、摊片、烘片，置于TO透明剂中脱蜡20 min，后按脱水相反顺序梯度水化。水化后按以下程序进行染色：苏木精染液10～20 min，避开切片位置缓流水水洗，1%盐酸分色，水洗，50℃温水中反蓝，水洗，镜检染色效果，伊红染液，水洗，镜检着色程度，脱水，TO透明剂Ⅰ、Ⅱ（各1～5 min），中性树胶封固，镜检。

1.4 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件分析数据，计量数据以均数±标准差表示，采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 模型组大鼠烟熏+冷风刺激第5 d后，相继出现活动减少、皮毛发黄稀松脱落、体重增长减缓、大便变稀，少数大鼠在烟熏时出现喷嚏和啰音。在注射LPS后，模型组大鼠均出现啰音，烟熏过程中更加明显。

2.2 两组不同时间体重比较 造模前，两组体重对比无显著差异（P＞0.05）；造模15 d后至造模结束，与正常组相比，模型组大鼠体重增长明显减缓（P＜ 0.01，表 1）。

2.3 两组脏器指数比较 按照脏器指数公式：脏器指数=（脏器重/体重）×100%，计算各脏器指数后发现，在造模结束时，与正常组相比，模型组肺脏指数、脾脏指数、胸腺脏器指数均明显降低（P＜0.05～P＜ 0.01，表 2）。

表1 两组不同时间体重比较(g)

表2 两组脏器指数比较(n=10)

2.4 两组肺组织形态学差异 正常组肺间质仅少量炎细胞浸润（图1），其余基本正常。模型组各级支气管管腔扩张，黏膜上皮坏死脱落，假复层纤毛柱状上皮大片脱失，黏膜下管壁组织疏松、水肿，肺泡壁明显增厚，血管扩张充血（图2），大量炎细胞浸润（图3），肺间质炎症细胞浸润，部分肺泡壁断裂、融合（图 4），形成轻度肺气肿（图 5）。

3 讨论

在呼吸系统疾病实验研究中，多选择以大鼠作为模型动物，主要因为其生存能力和抗病能力强于豚鼠和小鼠，能够忍受长时间的造模过程，体型较小，在造模过程中便于批量复制和控制。本实验在造模的过程中，烟熏模拟长期空气污染的环境背景，冷风和LPS则扮演着外邪入侵的角色，可以模拟肺气虚外感证型的发生发展过程。本实验的创新之处在于，将经典的LPS注射环节改良为采用小鼠灌胃针，通过经口气管注射LPS的方法，这样可以减少直接注射LPS可能造成的对咽部、气管的机械损伤，并减少由此而造成的术后感染、损伤性炎症反应等干扰因素，能够更加接近于肺气虚外感证型的自然发生、发展过程，且防止或减少动物的意外死亡发生。

图1 正常组大鼠肺组织（HE×100）

图2 模型组大鼠肺组织见血管扩张充血（HE ×100）

图3 模型组大鼠肺组织见炎细胞浸润（HE ×400）

图4 模型组大鼠肺组织见肺泡壁断裂（HE ×400）

图5 模型组大鼠肺组织见轻度肺气肿（HE ×100）

本实验结果显示，从模型大鼠一般情况、生长变化、脏器指数以及肺组织形态学变化等来看，大鼠造模后的各项指标都较符合“肺气虚外感”证型，能为后续研究提供更多的有利条件。

综上所述，“烟熏+冷风刺激+改良经口气管注射LPS”的方式能够成功建立“肺气虚外感”大鼠模型，该方法能减轻对大鼠呼吸道的机械损伤，减少术后伤口感染等干扰因素，更符合肺气虚外感的病理生理演变过程。

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