犬猫流感病毒的研究进展

宋士凯，孙怡朋

（中国农业大学，北京 100193）

A型流感病毒可以引起禽、人和猪等多种宿主的急性呼吸系统疾病，是一种世界范围的重要病原微生物。A型流感病毒具有广泛的宿主特异性，能导致多种宿主感染，根据感染宿主类型的不同，可将流感分为禽流感、猪流感、人流感、犬流感和猫流感等。早期人们认为A型流感病毒不能在自然条件下感染犬、猫，但后来各亚型流感病毒被相继从具有呼吸道症状的病犬、猫中分离出来。

1 犬流感病毒

虽然早在20世纪60年代，犬肾细胞（madindarby canine kidney，MDCK）就被用来培养各种流感病毒[1]，但还未发现犬可作为流感病毒宿主。1972年，Nikitin等[2]首次证明，在实验室条件下人H3N2病毒可以感染犬，并通过血清学调查证明犬在自然状态下也能感染人H3N2病毒，但未能分离出病毒。直至2004年，人们才第一次从具有呼吸道症状的病犬中分离出H3N8亚型犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV），之后又相继分离出多种亚型流感病毒。犬成为继猪、马、禽之后的又一重要流感病毒宿主，其宿主作用及在流感病毒跨宿主传播中的作用越来越受到关注。

1.1 马源H3N8亚型犬流感病毒

1.1.1 H3N8亚型犬流感病毒的流行情况 2004年1月，在美国佛罗里达州的一个赛犬场里22只赛犬爆发严重呼吸系统疾病，导致8只赛犬死亡。对其中6只病死赛犬进行病理剖检，发现呼吸系统发生严重病变，表现为出血性支气管炎、支气管肺炎和胸膜炎。将这些病死犬的肺脏匀浆接种各系细胞，最终通过犬肾细胞（MDCK）中分离到1株犬流感病毒。经实验室诊断发现，分离到的病毒为 H3N8 CIV，且其8个片段与马源H3N8流感病毒亲缘性最高，达96%以上[3]。在实验室条件下，用H3N8流感病毒感染健康犬，同样能引起犬的急性呼吸道症状，这表明H3N8亚型流感病毒是引起22只赛犬爆发呼吸系统疾病的“幕后真凶”。H3N8 CIV成为从犬上分离得到的第1株流感病毒，暗示H3N8流感病毒由马向犬跨物种传播。

Anderson等[4]对1984～2004年储存的血清进行了回溯性调查发现，H3N8 CIV在1999年便开始在美国的赛犬中流行，但直到2004年才在收容犬和宠物犬中出现，之后广泛流行于美国德克萨斯[3]、佛罗里达、纽约、加利福尼亚等多个州[5]，呈现明显的地方流行性特征。2005年以后，美国分离到的H3N8 CIV与H3N8马流感病毒（Equine influenza viruses，EIV）都有很高的亲缘性，但与2004年首次分离株相比，已形成新的独立分支[6]。目前，流行于美国的H3N8 CIV在进化树上已形成科罗拉多、宾夕法尼亚和纽约三大地域分支[7]，表明H3N8 CIV在不同地域发生了相对独立的适应进化。

总之，H3N8亚型流感病毒是从犬中分离到的第1种流感病毒，它是由H3N8 EIV传播到犬后不断进化而来。目前，该病毒主要在美国犬群中持续流行，并且已形成稳定谱系。虽然，在英国[8]、澳大利亚[9]也曾有关于H3N8亚型流感病毒被分离到的报道，但未能持续流行。Zhou等[10]通过HI和微量中和实验，对2015年5月～2015年11月期间在中国广州、深圳、北京和上海收集的宠物犬血清进行血清学调查，结果发现H3N8亚型流感病毒的血清学阳性率为0.83%，这是中国地区犬感染H3N8亚型流感病毒的首次报道。然而，目前为止中国犬群中并未分离到H3N8亚型流感病毒，表明该病毒在中国地区未能形成流行趋势。

1.1.2 H3N8犬流感病毒的生物学特性 虽然早期的研究表明，H3N8 EIV不能造成除马以外的其他物种（包括人）的呼吸系统疾病[11]，但2004年马源H3N8 CIV在美国引起赛犬急性呼吸系统疾病的爆发[3]。犬呼吸道中的鼻粘膜、气管和支气管纤毛上皮细胞上存在大量α-2,3唾液酸受体[12]，H3N8 CIV主要感染犬的呼吸系统，引起一系列的呼吸系统疾病。犬感染H3N8亚型流感病毒后，轻者发热、咳嗽，持续数十天后恢复健康；重症者表现出出血性支气管炎、支气管肺炎、胸膜炎，甚至急性死亡。通常在病犬支气管、气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞中可检测到病毒抗原，许多自然感染犬会继发细菌性肺炎，死亡犬还会出现严重的肺出血并导致血胸[13]。

H3N8 EIV可以引起马的自然感染，并能从马跨物种传播给犬，但目前没有证据表明H3N8 CIV能回传给马[14]。尽管H3N8 CIV起源于H3N8 EIV，但两者之间的生物学特性具有很大差异。它们的HA蛋白都具有α-2,3唾液酸受体结合特性，但两者HA基因并非完全相同，与 H3N8 EIV相比，H3N8 CIV的HA序列主要发生了两处变异，分别是位于受体结合区域的 W222L 和对于膜融合活性至关重要的 T30S。尽管 W222L 并未彻底改变其受体结合特性，但这两个突变可能促进了 H3N8 CIV对犬的感染[15]。早期的研究表明H3N8 EIV不能引起小鼠感染[16]，但Castleman等[14]发现，H3N8 CIV能有效感染小鼠，可见犬在H3N8亚型流感病毒的跨物种传播中具有重要的中间宿主作用。

尽管目前为止，没有任何关于人感染H3N8 CIV的报道，血清学调查也未在人血清中发现抗H3N8 CIV的抗体，但并不能排除该病毒可能会通过犬与人的密切接触而感染人，因此有必要对犬流感病毒进行持续监测。

1.2 禽源H3N2亚型犬流感病毒

1.2.1 H3N2亚型犬流感病毒的流行情况 2007年5～9月，在韩国南部Kyunggi省和Jeolla省的几个宠物诊所和犬舍里多个品种的犬相继爆发严重呼吸系统疾病，临床表现为厌食、发烧、咳嗽和流涕等症状，部分病例后期病情加重导致死亡。Song等[17]将病犬鼻分泌物接种11日龄鸡胚进行病毒分离，接种后3～4 d收集尿囊液，进行RT-PCR扩增和序列测定，最终测序结果显示，分离到的病毒为 H3N2 亚型流感病毒，其8个片段与禽源 H3N2 流感病毒进化关系最近，达95.5%～98.9%。在实验室条件下，将分离到的H3N2 CIV通过鼻腔接种方式感染健康比格犬，同样能引起犬的急性呼吸道症状，这表明H3N2 CIV是引起韩国犬呼吸系统疾病爆发的元凶。H3N2 CIV成为从犬上分离得到的第2种流感病毒，是H3N2亚型流感病毒由禽向犬的跨物种传播。

2007年7月～12月，Lee等[18]对H3N2 CIV在韩国犬群中的流行情况进行了血清学调查，共采集了829份血清样本，结果发现犬群中H3N2犬流感病毒的血清阳性率高达19%，其中一犬场的血清阳性率更是达到了100%，表明H3N2 CIV在韩国犬群中已经广泛流行。Lee等[19]通过ELISA、HI和微量中和实验，对2004～2009年间韩国保存的犬血清进行了回溯性研究发现，其实早在2005年H3N2 CIV就已经出现在韩国犬群中。

2006年5月～2007年10月，我国南方地区（广东省）出现4例患严重呼吸系统疾病的病例，发病犬的临床症状均表现为咳嗽、喷嚏、流涕和低烧（39.6～39.9℃）。Li等[20]采集发病犬的鼻拭子，处理后接种SPF鸡胚，结果分离出4株H3N2 CIV，经遗传进化分析表明，这4株病毒的8个基因片段与2007年韩国首次分离的禽源H3N2 CIV的亲缘关系最近。此后，在我国辽宁省[21]、北京市、黑龙江省[22]、广东省[23]、浙江省[24]和江苏省[25]等地区多次分离到H3N2 CIV。同时，大量的血清学调查表明，H3N2 CIV在中国犬群（包括宠物犬、流浪犬和养殖犬）中已经广泛流行[24,26]。

2012年1月，泰国曼谷地区一家宠物医院出现1例患呼吸道症状的病例，不久从该病犬中分离到1株H3N2 CIV，序列比对表明，该株病毒与韩国、中国地区分离到的H3N2 CIV的同源性最高[27]。但此后，泰国地区未再出现H3N2 CIV感染犬的相关报道。

2015年2～3月，禽源H3N2 CIV在美国芝加哥地区爆发，随后的5个月内，美国中西部地区超过1000只犬受到感染，其他23个州也相继出现H3N2 CIV感染犬的病例。全基因组测序结果显示，2015年美国分离到的H3N2 CIV与韩国2015年分离到的H3N2 CIV亲缘性最高，各基因片段核苷酸同源性达98%以上[28]。序列分析表明，2015年流行于韩国的H3N2 CIV引入到美国，造成了本次H3N2 CIV疫情的爆发，这标志着H3N2 CIV的流行区域已经由亚洲扩大到北美地区。最近的研究表明，美国不同州的H3N2 CIV在遗传进化树中呈现地域性差异[29]。

1.2.2 H3N2犬流感病毒的生物学特性 2007年，韩国首次出现H3N2 CIV，该病毒在感染犬后，能引起一系列呼吸系统疾病，并诱发严重的永久性肺炎，但不会引发肺脏以外的其他脏器感染[30]。然而，Zeng等[31]发现，将2010年中国江苏省分离的H3N2 CIV接种犬后，诱发了广泛的肺脏外感染，即除呼吸系统外，肝脏、脾脏、肾脏、脑和十二指肠等脏器均发生严重损伤并能检测到病毒抗原。2015年芝加哥地区感染H3N2 CIV的犬，其喉、咽和气管表面覆盖一层纤维性渗出物，双侧肺部出现多发性胸膜坏死、出血、充血和肺水肿[28]。

H3N2 CIV由禽跨物种传播到犬，经历了一个不断适应性演变的过程。对H3N2 CIV的HA和NA基因进行序列分析发现，与其禽源H3N2祖先病毒相比，H3N2 CIV的HA基因有7处突变，6处位于HA1（T10A，D81N，L111I/V，A160T，D172N，W222L）；1处位于HA2（D489N）[32]。其中，HA1的D81N、A160T 和 G209S突变分别位于其E、B和D抗原位点处； W222L 突变发生在其受体结合位点处，已有研究表明，此突变可以增强病毒对α-2，3 唾液酸受体的结合性，可能因此加强了病毒对犬的感染[32]；此外，T10A 突变使其失去了一个潜在的糖基化位点，而 D81N 突变则增加了一个糖基化位点；在 NA 的抗原位点处也发生了一些突变[33]。2007 年及之前的毒株 HA序列含有 PEKQTR/G 裂解位点基序；而 2007年以后的毒株 HA 裂解位点基序则为 PERQTR/G，其中2009年北京分离的1株病毒含有特殊的 PERRTR/G 裂解位点，该毒株的 HA 蛋白具有更强的裂解活性[23]。2009年及之后毒株的 NA茎部在74～75位点处有2个氨基酸的插入[23]，这些变异可能会改变病毒的生物学特性。

尽管H3N2 CIV起源于水禽，但目前没有证据表明它能从病犬回传给禽类，同样实验室条件下，它也不能通过鼻内接种的方式使鸡或鸭等禽类感染[25]。然而，H3N2 CIV却能在小鼠、豚鼠和雪貂等哺乳动物的呼吸道有效复制，表明犬可能在禽流感病毒的跨物种传播中发挥重要中间宿主作用。H3N2 CIV不仅能在犬群间有效传播，还能通过飞沫传播从犬传播给猫，并通过直接接触感染雪貂[25,34]。

H3N2 CIV对公共卫生健康的潜在威胁，不仅仅体现在其在犬间的广泛流行和对犬的严重致病性，还在于它可能与其他亚型流感病毒发生重排，导致宿主范围、致病性等发生改变。2012年，韩国犬中分离到1株H1N1/09人流感病毒和禽源H3N2 CIV的重排病毒，该病毒的HA基因来自H3N2 CIV，其余7个基因片段由H1N1/09人流感病毒提供[35]。同年，在韩国地区又相继分离到H1N1/09大流行病毒和H3N2 CIV多种方式的重组病毒（如携带H1N1/09大流行病毒M基因的H3N2 CIV；携带H1N1/09大流行病毒PA、NS 和 M 基因的H3N2 CIV等）[36,37]。2017年，Sun等[38]以pdmH1N1和H3N2 CIV为骨架，通过将这2株病毒基因进行随机重组，拯救出51株重组病毒，实验证明相对于经典H3N2 CIV，这些重排病毒具有更强的（接触）传播能力、复制能力、致病性。CIV与人流感病毒的频繁重排，暗示CIV可能会不断朝着适应人的方向演化，进而产生能感染人的重排病毒，对公共安全造成威胁。

1.3 其他犬流感病毒 目前，世界上流行的犬流感病毒主要为马源H3N8 CIV和禽源H3N2 CIV两种亚型，它们都呈地方流行性，其中H3N8 CIV主要流行于美国，而H3N2 CIV主要流行于亚洲地区，近期也有在美国流行的趋势。除此之外，在犬上还相继分离到其他多种亚型流感病毒，但都是散发个例，没能形成流行趋势。

2009年，一种新型 H1N1人流感病毒席卷全球，造成大批人感染。同年，孙莎莎等[39]在北京的宠物犬中也分离到 2 株大流行 H1N1/09 病毒，并通过实验证明大流行 H1N1/09 病毒可以有效感染犬，但不能在犬群间有效传播。2012～2013年，Sun等[40]进行的血清学调查显示，中国宠物犬群中，H3N2 CIV、H1N1/09和人H3N2流感病毒的血清学阳性率分别为3.5%、1.5%和1.2%，说明犬除了可以感染禽源H3N2 CIV外，还能感染人H3N2和H1N1/09亚型流感病毒。

2014年泰国的一只犬在吃了感染高致病性H5N1流感病毒的鸭子后死亡[41]，研究人员从其体内首次分离到H5N1流感毒株。同年在泰国曼谷进行的血清学调查发现，检测的 629 份犬血清样本中有160份表现为H5N1亚型流感病毒阳性[42]，但并没有找到H5N1亚型流感病毒在犬群中传播的证据。除了H5N1 亚型以外，2009年，在我国山东省，1株重组H5N2 亚型流感病毒从犬中分离出来，病毒的 NA 来源于 H9N2 禽流感病毒，而其他7个片段均来源于H5N1 猪流感病毒[43]。将 H5N2 CIV 感染犬，能诱发中度呼吸系统综合症，对犬并不致死；且病毒可以通过直接接触在犬群间传播[44]。H5N2 CIV 不仅能在犬群内传播，还能通过直接接触将病毒传播给鸡和猫，且鸡对 H5N2 CIV 更易感[45]。

2010年1月～2011年12月，Sun等[46]在广西省多个宠物医院和犬场的犬中，采集到588份鼻腔粘液样本，处理后接种10日龄SPF鸡胚，结果首次在犬上分离出13株H9N2亚型流感病毒。遗传进化分析显示，此病毒的8个基因片段分别来自5株H9N2禽流感病毒，表明该H9N2 CIV 可能由禽传播到犬。

2 猫流感病毒

研究发现，猫及猫科动物都对流感病毒十分易感，它们在食入感染过流感病毒的动物性食品或接触感染过流感病毒的人、畜、禽后，很容易被感染，目前在猫及猫科动物身上已分离到多种亚型猫流感病毒（Feline influenza virus，FIV），包括H1N1、H5N1、H5N6及H7N2等。

2.1 H5亚型猫流感病毒 2003～2004年，高致病性H5N1亚型流感病毒在东南亚地区爆发，不仅造成家禽的大批死亡，据官方报道还发生了39例鸟-人直接传播事件，其中24例死亡[47]。在这次疫情中，也有关于家猫和动物园猫科动物在吃了感染H5N1流感病毒的鸡后发病死亡的报道。这彻底颠覆了之前人们关于家猫可以抵抗A型流感病毒感染的认识。

2004年2月，在泰国爆发高致病性H5N1禽流感期间，一只家猫在吃过鸽子尸体5天后突然发病，表现为精神沉郁、气喘和41℃高烧，发病2天后表现出惊厥、共济失调最终死亡。猫的尸检显示脑充血、结膜炎、肺水肿、严重肺炎、肾充血和肠浆膜出血等。将病死猫的组织研磨液接种鸡胚，最终分离到1株H5N1亚型流感病毒，序列比对结果显示，该病毒与死鸽上分离到的病毒一致，都属于当时泰国流行的H5N1禽流感病毒，这表明FIV是直接通过食入方式由禽传播而来[48]。Kuiken等[49]用H5N1禽流感病毒实验室感染家猫，结果感染猫表现出类似的临床症状，表明H5N1禽流感病毒确实可以感染家猫。

2014年5月，中国正式确认首例人感染H5N6型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）。同年，在猫上分离到H5N6亚型流感病毒[50]，遗传进化分析表明该病毒来自禽（野鸟），但直到2016年才再次在猫身上分离到该亚型流感病毒。2016年，中国广东省的几只流浪猫出现精神沉郁、气喘、高烧和昏睡症状，最终死亡。将病死猫的肺脏匀浆接种鸡胚进行病毒分离，并使用RT-PCR进行病毒鉴定，测序结果显示该病毒是新型H5N6重组病毒，其基因组8片段分别来自H5N6、H9N2和 H7N9流感病毒[51]。研究表明该重组病毒具有更强的哺乳动物适应性，能在小鼠体内复制。

2.2 H1N1亚型猫流感病毒 2009年，新型四源重排猪源H1N1人流感病毒席卷全球，造成大批人感染。尽管该型病毒只在人间传播，偶尔也会从感染的人传播到易感动物（如猪、火鸡和雪貂等）上，但一般认为它不会造成家养宠物的感染。然而，Sponseller等[52]首次报道了家猫的H1N1感染，这引起各界人士的广泛关注。

2009年，美国爱荷华州立大学劳埃德兽医中心接诊了1例精神沉郁、食欲下降并患有呼吸道症状的病猫。据猫主人陈述，该猫在出现临床症状之前，3名家庭成员中的两名曾经历过一种以发热、咳嗽和肌痛为特征的上呼吸道疾病，4～6天后该猫发病。Sponseller等[52]从该猫的支气管肺泡灌洗液中分离到1株H1N1流感病毒，序列比对发现该毒株与美国2009年人流感大流行分离株的同源性最高，其中HA、NA、M基因的同源性分别达到99.4%、99.4%和99.8%。

Lohr等[53]首次报道了大流行H1N1/2009流感病毒引起家猫发生致死性呼吸道疾病的案例。2009年，美国俄勒冈州一只10岁的雄性短毛猫和一只8岁的雌性短毛猫，在患严重呼吸道疾病不久后死亡。病理剖检发现，两只猫的肺叶呈弥漫性实变和不完全性塌陷。组织学检测发现，两只猫都表现为中度到重度的坏死性支气管间质性肺炎。最终，它们的鼻分泌物和肺匀浆中分离到2株A型流感病毒，经RT-PCR鉴定和测序发现，该病毒为大流行H1N1/2009流感病毒。

血清学调查表明，猫中A型流感感染的血清阳性率可能高于预期。2009～2010年，美国俄勒冈州进行的血清学调查发现，家猫中大流行H1N1/2009流感病毒、季节性H1N1流感病毒、H3N2流感病毒的血清阳性率分别达22.5%，33%和43.5%[54]。而2012～2013年，中国东北地区进行的血清学调查[55]发现，该地区的1255只猫中大流行H1N1/2009流感病毒的血清阳性达21%。

2.3 其他亚型猫流感病毒 Kim等[56]研究发现禽源H3N2 CIV不仅能在犬群间有效传播，还能通过飞沫传播从犬传播给猫，并通过直接接触感染雪貂。2010 年在韩国的家猫和流浪猫中都分离到 H3N2 亚型CIV[57,58]。Zhou等[59]2010～2012年在中国南方地区进行的血清学调查和Zhang等[60]2010～2014年在中国北方地区进行的血清学调查表明，活禽市场的流浪猫和家庭宠物猫血清中含有 H3N2 CIV的抗体 。这些均暗示了猫可能是H3N2 CIV从犬传播给猫科动物的一个中间宿主。

随着更多亚型FIV（如低致病性H7N2亚型流感病毒于2016年美国首次在猫上被分离到）被从猫上分离到，猫在流感病毒传播中的作用越来越受人们关注。

综上所述，犬、猫在流感病毒传播中的中间宿主作用越来越突出，很多以前被认为不会突破种间屏障感染哺乳动物的流感病毒相继被从犬、猫上分离到。此外，犬、猫在流感病毒遗传演化过程中的“混合器”作用越来越明显，各亚型犬、猫流感病毒间及犬、猫流感病毒与人流感病毒间的频繁重排，产生多种危害更大的重排病毒，增加了其对公共卫生健康的危害。随着经济、贸易全球化进程的不断推进，原本只呈区域性流行的犬、猫流感病毒，逐渐突破地理屏障，传播到世界各地，极大增加了流感病毒全球化流行的风险。鉴于犬、猫与人的亲密接触性，犬、猫流感病毒在犬、猫群体间的广泛流行及不断演化，对公共卫生健康产生潜在威胁，各国应加强流行病学调查，对犬、猫流感病毒的流行情况进行实时检测，降低大规模爆发的风险。

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