施加解磷菌剂对油茶根际微生物和土壤酶活性的影响

李正昀，王 舒，张 扬，张林平，李 冬

(江西农业大学 林学院；江西特色林木资源培育与利用2011协同创新中心，江西 南昌 330045)

油茶(Camelliaoleifera)是我国特有的高级油料树种，是一种发展前景较好的经济植物。目前，我国油茶栽培面积达24.44万hm2，主产区为湖南、江西和广西等红壤区，土壤有效磷缺乏和磷素积累问题较为严重[1]。为提高油茶产量，通常会施入大量的磷肥以达到增产的目的，但施入的磷肥仅有5%～10%在当季被吸收利用，其余的磷被转化为土壤中难溶性磷酸盐[2]。因此，如何通过生物学途径释放土壤中无效态库存磷，对于提高油茶土壤磷素有效性，减少磷肥使用量，减轻环境污染及维持生态系统的问题具有重要意义。

解磷细菌是土壤中的一类溶解磷酸化合物能力较强的细菌的总称，可合成或分泌一些有机酸和酶类，提高土壤中有效磷含量，改变植物根际微生物的群落结构，从而促进植物的生长发育[3-6]。目前，解磷菌剂已在农作物上开展了大量应用研究[7-8]，而在木本植物上应用，特别对根际土壤微生态环境和土壤酶活性的影响报道甚少[9-10]。为此，本试验在3种施磷水平下，在油茶苗根际周围接种不同解磷菌剂，研究不同解磷菌剂对油茶苗根际微生物和酶活性的影响，为解磷菌剂对土壤微生态环境的影响提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株为阿耶波多杆菌(Bacillusaryabhattai)、耳假单胞杆菌(Pseudomonasauricularis)，源自江西农业大学森林保护实验室，其液体培养基中的溶磷率分别为19.75%和11.88%[11-12]。供试植株为油茶赣兴46的1年生嫁接苗，由江西省林业科学研究院提供。供试土壤采自江西农业大学中药园基地，采集深度为0～20 cm，红壤土，土壤理化性质为：pH 5.25，有机质含量43.71 mg·kg-1、碱解氮含量94.68 mg·kg-1、有效磷含量2.80 mg·kg-1、速效钾含量15.80 mg·kg-1。样土风干后过筛(1 mm)，并将红壤∶沙土∶泥炭土以6∶3∶1(V∶V)混合灭菌后备用。

1.2 试验设计

盆栽试验采用2因素完全随机区组设计，因素1为菌剂，共设5个处理：1)耳假单胞杆菌菌剂50 mL(T1)；2)阿耶波多杆菌菌剂50 mL(T2)；3)混合菌剂 (T1∶T2=1∶1) 50 mL(T3)；4)LB培养液50 mL为对照(CK1)；5)无菌水50 mL为土壤对照(CK2)。因素2为施磷水平，参考胡冬南[13]等和本试验盆栽土壤的特点，共设3种施磷处理：P1(不施磷肥，即0 g·kg-1)、P2(过磷酸钙1 g·kg-1)、P3(过磷酸钙2 g·kg-1)，每处理5个重复。所用磷肥含P2O512.4 %。为满足植株对N、K营养的需求，每个处理均施入尿素(N 300 mg·kg-1)和硝酸钾(K2O 200 mg·kg-1)，并与土壤混合均匀，每盆装入3 kg土壤。2013年9月于江西农业大学中药园温室大棚内进行盆栽试验，油茶苗正常管理。

1.3 菌剂制备及接种

将不同解磷细菌分别接种至LB液体培养基中培养48 h(28℃，180 r·min-1)，测定各菌株悬浮液OD600值并调整至0.5。不同解磷细菌菌悬液按3%(v/v)分别接种至盛有300 mL LB培养液的三角瓶(500 mL)中，28℃，180 r·min-1振荡培养至其含菌量均达到108CFU·mL-1，即为解磷细菌液体菌剂。用无菌注射器将菌剂(50 mL)分别注射至移栽成活且生长比较一致的油茶苗根际周围，CK1每盆注射无菌水50 mL，CK2注射灭菌后的LB液体培养基50 mL，每个处理10个重复。

1.4 土壤微生物数量和酶活性测定

2014年4月将带土植株取出，轻轻抖动附在根系上的土壤作为根际土壤样品，样品分成2份，1份带回实验室立即进行土壤微生物测定，另一份样品风干后过筛并测定土壤酶活性[14]。采用稀释平板法测定土壤微生物数量，具体方法参照李阜棣[15]等，采用NA培养基分离细菌，改良高氏1号合成培养基分离放线菌，马丁氏孟加拉红培养基分离真菌。采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定土壤蔗糖酶活性，采用靛酚蓝比色法测定土壤脲酶活性，具体方法参考文献[16]，每个处理3个重复。

1.5 数据处理分析

试验所得数据采用Excel 2010软件进行分析作图，同时，应用SPSS V13.0软件进行双因素方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 对根际真菌数量的影响

由图1可知，不同解磷菌剂的施入降低了油茶苗根际真菌整体代谢活性和数量，其中T1、T3减幅较多，T2减幅最小，且与CK1差异显著(P<0.05)。试验对照CK1和CK2之间无显著差异(P<0.05)，表明添加LB培养液(灭菌)对根际真菌数量无影响。

图1 解磷菌剂对油茶苗根际真菌数量的影响

2.2 对根际细菌数量的影响

由图2可知，不同施磷水平下接种不同解磷菌剂均可增加油茶根际细菌数量，其中P3水平增幅最大。根际细菌数量随着施P量的提高而逐渐增加，可能是因为解磷菌剂将难溶性磷转化为有效磷，有效磷含量的增加提高了土壤质量，从而增加细菌的生长和繁殖。各菌剂处理以T3增幅和数量最大，并显著高于T1、T2、CK1和CK2(P<0.05)，表明混合菌群较单一菌剂更能提高油茶苗根际细菌整体代谢活性和数量。试验对照CK1和CK2间无显著性差异(P<0.05)，表明单独添加LB培养液(灭菌)对根际细菌数量无影响。

图2 解磷菌剂对油茶苗根际细菌数量的影响

2.3 对根际放线菌数量的影响

由图3可知，不同施磷水平下接种不同解磷菌剂对油茶根际放线菌数量的影响不同，根际放线菌的数量均有所增加，其中P3水平增幅最大，随着施P量的提高，根际放线菌数量的增幅逐渐增加，各菌剂处理以T3增幅和数量最大，并显著高于T1、T2、CK1和CK2(P<0.05)，表明混合菌剂较单一菌剂更利于油茶根际放线菌数量的增加。对照CK1和CK2之间无显著差异，表明单独添加LB培养液(灭菌)对根际放线菌数量无影响。

图3 解磷菌剂对油茶苗根际防线菌数量的影响

2.4 对根际蔗糖酶活性的影响

蔗糖酶又叫转化酶，主要参与分解土壤中高分子量蔗糖，其活性表示土壤熟化程度的大小和肥力水平的高低。由图4可知，接种不同解磷菌剂对油茶土壤蔗糖酶活性的影响不同。在3种施磷水平下，与对照CK1相比，接种各菌剂均不同程度地提高了土壤蔗糖酶的活性，且差异显著(P<0.05)。其中P3水平增幅最大，结果表明在低磷胁迫作用下，抑制了蔗糖酶活性的增加。各菌剂处理以T3增幅最大，并显著高于T1、T2、CK1和CK2(P<0.05)，表明混合菌剂较单一菌剂更利于油茶土壤蔗糖酶活性的增加，在一定程度上提高土壤肥力。试验对照CK1和CK2间无显著差异，表明单独添加LB培养液(灭菌)对根际土壤蔗糖酶活性的增加无影响。

图4 解磷菌剂对油茶苗根际土壤蔗糖酶活性的影响

2.5 对根际脲酶活性的影响

土壤脲酶可催化尿素水解为氨和二氧化碳，其活性高低可以反映土壤的供氮能力。由图5可知，各菌剂对根际脲酶活性的影响不同。相对于对照CK1、CK2，在不同施磷水平下接种不同菌剂后根际土壤脲酶活性均有不同程度提高，但差异均不显著。试验对照CK1和CK2之间无显著差异，表明单独添加LB培养液(灭菌)对根际土壤脲酶活性的增加无影响。

图5 解磷菌剂对油茶苗根际土壤脲酶活性的影响

3 结论与讨论

土壤微生物(真菌、细菌、放线菌)是土壤生态系统中的重要组成部分，其群落的组成和活性对土壤肥力的保持和提高具有重要意义[17-19]。本研究采用接种法研究了施入不同解磷菌剂对油茶苗根际微生物群落数量的影响，结果表明，分别接种阿耶波多杆菌、耳假单胞杆菌及其混合菌群后，根际细菌和放线菌数量较对照均有所增加，而真菌数量减少，这和余旋[9]、董卿[20]、栗丽[21]等研究结果一致。根际细菌和放线菌数量增加，有利于改善根际土壤的微生态环境，进而提高土壤肥力和促进植物根系发育及养分吸收[22]。土壤真菌是重要的物质分解者，却与许多植物土传病害有关[23]。本研究仅对油茶苗接种解磷菌剂后一个生长时期内根际微生物的数量变化进行分析，不同时期根际微生物数量变化及优势菌群的变化规律及其相关性有待于进一步研究。

土壤酶活性能够反映土壤质量在时间序列或各种不同条件下的变化，而解磷菌剂对根际微生物数量及酶活性的影响与施入的磷素水平密切相关。有关研究表明解磷菌剂在不施入P肥时对根际微生物数量及酶活性的影响>施入P肥[9-10]，这与本研究结果正好是相反的，说明施磷具有提高土壤酶活性的作用。植物在土壤低磷条件下，根系表面积、生物量、根毛数量和长度等均有所增加，且根系分泌物如各种有机酸的含量和酶活性有所提高，可将土壤中难溶态磷转化成可溶性磷，更好地被植物吸收[24-25]。本试验中土壤酶与土壤微生物之间具有密切的关系，与前人研究结果一致[26]，说明微生物生命代谢活动的增强能够提高土壤酶活性，进而加速了土壤中物质转化，为微生物创造良好的土壤微生态环境。

众多研究表明，不同解磷细菌之间具有协同作用，混合接种要比其中任何一种单一接种更能促进植株生长和营养吸收[27-28]，这与本研究结果是一致的，主要是由于混合菌群在根际养分和生态位的竞争中更有优势，且2株高效解磷菌剂分离自油茶根际[11-12]，能在根际或根部有效定殖，从而发挥解磷功效，至于不同解磷细菌之间协同作用机制需进一步深入研究。此外，本研究主要采用传统的平板培养法进行微生物培养和计数，存在一定局限性，因为土壤中有很多无法正常培养的微生物，因此，采用DGGE、RFLP或高通量测序等技术进行土壤微生物的研究是必要的，可提高试验结果的准确性。

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