B7家族新成员HHLA2的研究进展

王泽群 综述 魏素菊 审校

(河北医科大学第四医院肿瘤内科，石家庄 050011)

近年来，肿瘤的免疫治疗成为继分子靶向治疗之后的新热点。以B7/CD28家族成员如PD-1和PD-L1为靶点的免疫检查点抑制剂的新的免疫疗法，最近已经被用于人肺癌的治疗并获益。HHLA2是一种新发现的B7家族成员，与T细胞的抑制性功能有关。在大多数正常组织中未检测到HHLA2蛋白表达，而在人类一些恶性肿瘤中过表达。HHLA2可能在肿瘤微环境中是一种新的免疫抑制机制，同样也是肿瘤免疫治疗的新靶点。HHLA2目前的研究还相对较少，本文就HHLA2的分子结构、表达模式、相关受体、功能作用及其与相关肿瘤的关系等作一综述，旨在为相关肿瘤的治疗进展提供新的参考。

1 HHLA2的生物学结构及演变

HHLA2是人类内源性逆转录病毒-H长末端重复序列结合体2(HERV-H LTR-associating)的简称[1]。人类的HHLA2基因位于3号染色体q13.13区域，与B7-1和B7-2基因相邻(q13.3-q21)。研究人员按顺序排列了开放阅读框架发现HHLA2的导出蛋白序列含有414个氨基酸比大多数B7成员要长，但是比人B7-H3要短。普遍认为HHLA2蛋白具有一个氨基酸末端信号肽，外功能区由串联的IgV-IgC-IgV的结构域、六N-连接糖基化的潜力点、一个跨膜区和49-aa胞质尾构成。HHLA2是一种拥有三个胞外Ig区域(IgV-IgC-IgV)的Ⅰ型跨膜分子，而B7家族的其他成员只有两个Ig区域(IgV-IgC)。为了验证这一结论，研究人员在小鼠胚胎成纤维细胞(3T3)细胞系中研究了HHLA2蛋白定位表达HHLA-YFP融合蛋白，并不表达内源性HHLA。共聚焦显微镜分析表明，HHLA2蛋白主要存在于3T3细胞的细胞膜和细胞质中。相反，人CTLA-4-YFP融合蛋白主要定位在3T3细胞内[2]。

在之前的研究中，研究人员应用进化分析将B7家族分为三组[3]。随着HHLA2加入B7这个大家族，研究人员应用PAUP 4.0b10[4]来评估人类B7蛋白质之间的关系。如图1所示[2]，系统地比较将B7家族分为三组：第1组包括B7-1、B7-2和B7h，第2组包括PD-L1和PD-L2，第3组包括B7x、HHLA2和B7-H3[3]。对第1组来说，CD28和CTLA4是这三个B7分子的受体，ICOS是B7h的受体而PD-L1结合B7-1。第2组，PD-1为PD-L1和PD-L2的受体。对第3组来说，TMIGD2作为HHLA2的受体之一[1,5]，其他受体尚未确定。系统进化的比较表明第3组的受体与第1、2组的受体并不是真正的同系物。基于序列分析表明，普遍认为HHLA2同源基因似乎在现有广泛的物种中存在，包括鱼类、青蛙、裸鼹鼠、大熊猫和猴子等灵长类物种。然而，相比其他B7 家庭成员，HHLA2在实验室小鼠和小鼠菌株中并不表达，使其成为第一个在人类中表达而在小鼠中不表达的B7家族成员[2]。

2 HHLA2的表达模式

目前HHLA2的表达在蛋白质水平是完全未知的[2]。为了检测蛋白质的表达，由于小鼠不表达HHLA2基因，研究人员生成了来自小鼠的一个单克隆抗体小组来对抗HHLA2。单克隆抗体的特异性是应用ELISA和流式细胞仪证实单克隆抗体是与HHLA2反应而不是其他B7家族成员。使用抗HHLA2单克隆抗体566.1，应用流式细胞仪在抗原提呈细胞上检测到HHLA2的表达。在人外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中的CD14阳性的单核细胞显著表达了HHLA2，这种表达被LPS和IFN-γ的刺激进一步调节。静息CD19阳性B细胞不表达HHLA2，但是可被LPS和IFN-γ诱导表达。尽管在LPS和IFN-γ刺激后，HHLA2在树突状细胞和T细胞中仍不表达。未来还需要进一步研究证实是否存在其他刺激可以诱导HHLA2在树突状细胞和T细胞中表达[2]。HHLA2在正常组织中的表达是有限的。研究表明大多数正常组织在蛋白质水平上并不表达内源性HHLA2，然而在胚胎滋养层细胞、肠道、肾脏、胆囊和乳腺上皮细胞中可表达HHLA2[6]。

3 TMIGD2，HHLA2的受体之一

HHLA2受体可以在包括T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞等多种免疫细胞中被找到。目前研究人员已经确定了HHLA2的受体之一，TMIGD2，也称为CD28H。TMIGD2可以在上皮细胞和内皮细胞起源的细胞中被检测到，而且当在内皮细胞系过表达时可以增加体外血管生成[7,8]。另外，TMIGD2作为一个兴奋性受体表达于幼稚T细胞表面。向CD28家族其他成员一样，TMIGD2是存在一个胞外IgV结构域、一个跨膜区和一个胞质尾的Ig总科成员之一。细胞外区域有两个可能的糖基化位点，胞质尾包含可被磷酸化的酪氨酸残基和与多重SH3信号分子相关的脯氨酸结构域[8]。和HHLA2一样，TMIGD2不存在于小鼠中而存在于人和灵长类动物中[7]。通过序列分析，研究人员分析，TMIGD2、IGPR-1和CD28H是同一种分子，IGPR-1最初被认定为一个参与血管生成的黏附分子，而CD28H是最近报道的高通量跨膜蛋白的受体[6]。

4 HHLA2的功能及作用

4.1HHLA2抑制T细胞受体介导的CD4和CD8 T细胞的增殖 研究数据显示，在抗原提呈细胞(APCs)中可检测到HHLA2蛋白，而且在T细胞上有HHLA2受体表达。研究人员应用改进的系统检测HHLA2是否能够调节T细胞功能[3]。在这个系统中，提纯的T细胞被盘状包裹的CD3的单克隆抗体激活，这种T细胞的激活在3～5 d内可被检测到。研究人员首先进行了抗CD3剂量滴定，发现从不同的正常献血者来源的T细胞，需要不同浓度的抗CD3以达到中等水平的增殖。因此，每个捐献者的T细胞试验应用不同的适宜浓度的抗CD3[2]。研究人员应用噻唑蓝试验，在固定化HHLA2-Ig、对照Ig或B7x-Ig存在的情况下量化抗CD3引起的T细胞的激活。HHLA2-Ig显著降低抗CD3诱导的T细胞的活化。作为对照，在同一系统中B7x-Ig同样抑制T细胞激活，符合之前的报道[3]。由于CD4和CD8 T细胞组成性地表达HHLA2受体，研究人员下一步检测HHLA2是否可以抑制CD4和CD8 T细胞。从PBMCs中提纯的T细胞被琥珀酰亚胺酯(Carboxyfluorecein succinimidyl amino ester,CFSE)标记，并在固定化HHLA2-Ig、对照Ig或B7x-Ig存在的情况下应用抗CD3刺激5 d。这些细胞应用抗CD4和抗CD8进行流式细胞仪进行分析。HHLA2介导的抑制作用，是由控制CD4和CD8 T细胞的数量和测量CFSE的荧光强度决定的。不出所料，当应用抗CD3和对照Ig培养时，CD4和CD8 T细胞都大量增殖，有超过55%的CD4和超过69%的CD8 T细胞分裂。然而，当应用抗CD3和HHLA2-Ig培养T细胞时，CD4和CD8 T细胞增殖显著减少，有不超过38%的CD4和不超过52%的CD8 T细胞分裂。类似的，B7x-Ig也抑制CD4和CD8 T细胞增殖，只有不到44%的CD4 T细胞和不到57%的CD8 T细胞分裂。因此，这些分析的结果证明，HHLA2抑制T细胞受体介导的人CD4和CD8 T细胞增殖，抑制程度与B7x类似[2]。

4.2HHLA2抑制T细胞分泌细胞因子 研究人员把从PBMCs中提纯的T细胞在固定化HHLA2-Ig或对照Ig存在的情况下应用抗CD3刺激3 d[2]。结果显示，从检测的13个T细胞来源的细胞因子中，发现有7个T细胞来源的细胞因子的分泌显著降低：IFN-γ(降低21%)、TNF-α(降低30%)、IL-5(降低39%)、IL-10(降低56%)IL-13(降低39%)、IL-17A(降低36%)、IL-22(降低35%)。HHLA2减少了IL-2和IL-9的分泌，但是差异并没有统计学意义[2]。此外，HHLA2并不影响细胞因子IL-1β、IL-4、IL-6或IL-12p70的分泌。这些研究结果显示，HHLA2可以抑制T细胞产生某些细胞因子。

5 HHLA2与相关肿瘤

研究证实，HHLA2在大多数恶性肿瘤组织中高度表达，包括乳腺癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、食管癌。这表明HHLA2表达可能是肿瘤进展的关键步骤，而且HHLA2可以通过对宿主抗肿瘤免疫的抑制赋予肿瘤生存优势[6]。HHLA2表达上调至少有两个机制：①炎症刺激。单核巨噬细胞可以使HHLA2表达增加，并在LPS和IFN-γ的刺激下，HHLA2可被诱导表达于B细胞。②人类基因组的基因拷贝数增加。基因拷贝数分析显示，绝大多数的HHLA2基因拷贝数在基底型乳腺癌中是增加的(>95%),这表明基因拷贝数的增加是癌症中HHLA2表达上调的机制之一。HHLA2的表达与两个预后因素有关：肿瘤晚期和淋巴结阳性，但与肿瘤的大小无关[6]。

5.1HHLA2与非小细胞肺癌 HHLA2在正常肺组织中并不表达，但在不同亚型的肺癌中广泛表达。研究已经证实，在66%的肺癌中存在HHLA2表达[9]。

HHLA2与肺腺癌中表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)突变状态有关。EGFR和KRAS基因突变是非小细胞肺癌中最常见的致癌基因改变。存在这些突变的肺癌患者有不同的发病机制、临床特点及病程[10]。在不同的突变类型中研究人员分析了HHLA2表达。在发现队列中，HHLA2染色阳性被发现在EGFR突变中占75.6%(31/41)，KRAS突变的62.9%，在野生型(EGFR和KRAS野生型)患者中占52.7%。在他们中，在EGFR突变的肺癌患者中的HHLA的表达显著高于野生型的患者(P=0.015)。类似的，在验证队列中，与野生型相比，EGFR突变的肿瘤HHLA2的表达明显增高(89% vs 69%，P=0.01)[9]。

HHLA2与肺腺癌中TILs高含量有关。肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)与HHLA2表达之间的关系正在研究中。肿瘤浸润性淋巴细胞已经被证明可以预示一些肿瘤的预后，但肺癌组织中TILs的预测价值仍存在争议。在一些研究中，高密度的TIL已经被证实在早期肺癌中无病生存率和无复发生存率较低[11]，但在另一些研究中没有相关记录[12]。在另一方面，在肺腺癌中，在适应突变状态以后，高TILs浸润和HHLA2表达之间有显著的关联。这表明，可能有不同的因素参与TIL募集，而在肺腺癌中HHLA2表达可能至少是参与TIL浸润的一部分。HHLA2结合多种免疫细胞的受体，包括T细胞和抗原提呈细胞，从而抑制人体CD4和CD8 T细胞的细胞增殖和细胞因子的产生[9]。

5.2HHLA2与乳腺癌 HHLA2在乳腺癌的蛋白质水平过表达，但是肿瘤细胞表达上调的机制尚不清楚[1]。三阴乳腺癌与雌激素受体阳性和HER2阳性乳腺癌相比是更具侵袭性乳腺癌亚型。在一项回顾性研究中，收集了50例局部或局部进展的乳腺癌患者，并收集他们的临床特点[1]。所有这些患者以手术作为主要治疗，后续行术后辅助化疗或放疗或术后放化疗。存在HHLA2高表达的三阴乳腺癌患者与淋巴结阳性和诊断时已晚期有关，表明与HHLA2低表达的三阴乳腺癌相比，HHLA2高表达的三阴乳腺癌更具有侵袭性。通过CbioPortal评估HHLA2基因变异，研究人员发现在基底型中有32%的HHLA2基因变异，而且在基底型乳腺癌中HHLA2基因拷贝数绝大多数是增加的(>95%)[1]。这表明在人类肿瘤中HHLA2蛋白上调的机制之一可能是基因拷贝数的增加[6]。

5.3HHLA2与骨肉瘤 研究人员发现在大多数骨肉瘤中都有HHLA2的表达。HHLA2在骨肉瘤中的预后作用最近被提出[13]。同时这项研究表明在骨肉瘤中，HHLA2与PD-L1是共表达的。在已经评估过PD-L1表达的一群病例样本中，可以检测到HHLA2的表达[14]。另外，在骨肉瘤中，HHLA2的表达与特异性免疫细胞亚型的肿瘤浸润有关。然而HHLA2的表达与高龄(50% vs 63%,P=0.66)、更糟的解剖部位(58% vs 67%,P=0.18)、在诊断中是否存在转移(67% vs 39%,P=0.18)、新辅助化疗的组织学应答(67% vs 36%,P=0.54)均没有关系，但是在这项研究中，HHLA2在转移性骨肉瘤中比在原发性骨肉瘤中的表达更多，差异具有统计学意义(93% vs 53%，P=0.02)[13]。在肿瘤中HHLA2的高水平表达(25% vs 50%)预示着总生存率的下降。HHLA2在肿瘤微环境中作为T细胞的共抑制分子的功能可以为肿瘤生存提供有利条件，因此HHLA2的表达与较差的预后有关[1]。还需要进一步的分析来评估HHLA2表达与骨肉瘤中预后不良的高危因素之间的关系[13]。

6 小结与展望

B7/CD28家族的配体和受体在正常状态或在感染、自身免疫和癌症等病理状态下的免疫应答的调节中扮演重要的角色[1]。HHLA2作为新发现的B7家族的一员，具有抑制T细胞的功能，TMIGD2作为HHLA2的受体之一在最近的报道中被提出。HHLA2与B7x、B7-H3同属于B7家族的第三组成员，但目前这些免疫检查点是如何协同起作用的还需要进一步的研究。但目前，受体的识别、缺乏可靠的有价值的抗体、HHLA2和TMIGD2在小鼠中表达的缺乏等问题仍然存在。尽管如此，体内和体外的研究都强调了这些新的受体和配体的重要性。HHLA2有可能成为肿瘤治疗的新靶点，如何抑制HHLA2通路，从而为肿瘤、感染及自身免疫疾病提供新的治疗策略，还需要进一步的研究。

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