CAR-T在晚期肺癌治疗中的研究进展①

刘 睿 李亚荣

(吉林大学第二医院肿瘤血液科，长春 130012)

1 CAR-T的发展历程及现阶段临床应用

1890年COLEY毒素的治疗拉开了肿瘤免疫治疗序幕，20世纪50年代，Burnet等阐释了免疫监视学说，指出肿瘤的形成是免疫逃逸的结果。2002年，Dunn等[1]在此基础上提出了肿瘤的免疫编辑学说。提出细胞毒性T细胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)在肿瘤的免疫应答中起关键作用。特异性抗原(如肿瘤细胞表面抗原)经抗原提呈细胞(Antigen presenting cells，APC)的摄取、加工、提呈后，与MHCⅠ类抗原形成MHC-抗原肽复合物。此种复合物与CTL的特异性识别受体(T cell receptor，TCR)结合后，从而实现抗肿瘤免疫应答。而肿瘤细胞通过分泌VEGF、TF-P、IL-10等细胞因子，以及下调肿瘤细胞表面MHC类分子或T细胞活化所需共刺激分子的表达，阻止了APC的成熟分化，干扰正常呈递过程，实现了免疫逃逸[2]。抗原嵌合受体T细胞(CAR-T)通过基因转染技术使T细胞表面表达靶细胞的抗原受体，以抗原特异性的方式和非HLA依赖的方式识别肿瘤细胞表面抗原并有效杀伤靶细胞[3]。

2 抗原嵌合受体T细胞(CAR-T)的主要结构

抗原嵌合受体主要由四部分组成，包括细胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区和细胞内信号转导区[4]。抗原结合区由识别肿瘤相关抗原(Tumor associated antigen，TAA)的特异性单克隆单链抗体(single chain Fv domain,scFv)构成，实现了对肿瘤细胞的特异性杀伤[5]。铰链区(也被称为间隔区)由CD8、CD28或IgGFc段构成，这一结构扩大了T细胞表面的抗原结合域。跨膜区由Ⅰ型跨膜蛋白(如CD4、CD8、CD28等)形成的跨膜序列组成。细胞内信号转导区主要由0～2个活化T细胞所需的共刺激分子[如:CD28、CD-134(OX40),CD137]以及CD3ζ构成，主要负责激活下游信号通路，引起T细胞的增殖和活化[6]。CAR-T的结构经历了如下四代变革。1988年，Finney等[7]构建了第一代CAR-T，主要由scFv与胞内单一信号分子CD3ζ构成。一代CAR-T与靶抗原结合后，使CD3ζ链的免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosinebas-ed activating motif,ITAM)磷酸化，与胞质蛋白酪氨酸激酶(PTK)Zap-70结合从而启动TCR，使T细胞停留在G-G1期。但因缺乏共刺激分子的协助无法活化，故不能进一步发挥抗肿瘤功能。

随后，研究人员在一代CAR-T的基础上加入了1个共刺激分子信号转导域，研究最广泛的共刺激分子是CD28。Barbara等[8]的研究证明含有CD28胞内结构域的CAR-T细胞有更强的增殖能力和持久性。Maher等[9]的实验证明含有CD28的前列腺特异性膜抗原(PSMA)二代CAR与第一代抗PSMA CAR相比，能释放更多的IL-2因子，引发更强的抗原抗体反应，持续裂解PSMA阳性的靶细胞。研究人员在间皮瘤肿瘤模型中发现[10],含CD137(4-1BB)的二代CAR-T与含CD28的二代CAR-T相比，有同等的抗肿瘤效果。同时发现含有CD137共刺激分子的CAR可减少CAR-T细胞的凋亡，促进抗凋亡蛋白(例如Bcl-xL)的表达，以及杀伤肿瘤细胞相关细胞因子的生成。

为了进一步优化CAR-T细胞的功能，研究人员设计出了含有两个共刺激分子的CAR-T细胞。Zhong等[11]在抗前列腺特异性膜抗原模型中发现含CD28/4-1BB/CD3ζ的三代CAR，能增加细胞因子的生成，以及体内CAR-T细胞存活率，提高抗肿瘤能力，激活PI3K/AKT通路，上调Bcl-xL的表达，减少CAR-T细胞凋亡。Pule等[12]的实验含有CD28/OX-40/CD3ζ的第三代CAR-T有更强的体外增殖力，以及在重复抗原刺激后持续裂解肿瘤细胞的能力。 Wilkie等[13]在MUC1-CAR的实验中发现含有CD28/OX-40/CD3ζ的三代CAR-T体外分泌IFN-γ的能力更强。

目前，研究人员正在进行四代CAR-T(TRUCKs)的研究[14]。通过在第三代CAR-T的基础上转染IL-12编码基因，增强CAR-T细胞释放IL-12的能力，促进巨噬细胞及NK-T细胞向肿瘤组织的趋化及迁移，增强对肿瘤细胞的杀伤能力[15]。

3 CAR-T细胞现阶段临床应用

3.1血液系统疾病 近期的研究表明，CAR-T细胞治疗血液系统恶性肿瘤的成功率非常高，特别是B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)。研究表明，应用CAR-T细胞疗法治疗的患者，甚至是异体造血干细胞术后的患者，完全缓解(CR)率可达70%～94%[16-18]。此外宾夕法尼亚大学针对B-CLL的第一个临床研究也获得了较好的结果，三名使用抗CD19的CAR-T细胞治疗的难治性晚期CLL患者中,两名患者达到完全缓解(CR)[19]。四年后，同一研究组的ORR达57%[20]。在这些积极的结果影响下，近年来大量针对血液系统抗原如CD19、CD20、CD22、CD30的CAR-T细胞的临床试验正如火如荼的展开。相关结果提示，CAR-T细胞疗法在霍奇金淋巴瘤(HL)、B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)、多发性骨髓瘤(MM)及急性髓性白血病(AML)的治疗中同样很有发展前景[21-24]。

3.2实体瘤 迄今为止，CAR-T细胞在血液系统恶性疾病的治疗中取得令人欣喜的成果。在此基础上，CAR-T细胞用于治疗实体瘤的研究逐步开展起来。研究较多的实体瘤类型有：乳腺癌、胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、神经母细胞瘤等。研究较多的靶点有：癌胚抗原(CEA)用于治疗结直肠腺癌、成纤维细胞活化蛋白(FAP)用于治疗恶性胸膜间皮瘤，双神经节苷脂GD2用于治疗神经母细胞瘤，人表皮生长因子受体2(HER2)用于治疗HER2阳性肿瘤，间皮素用于治疗胰腺癌，白细胞介素13受体α(IL-13Rα)用于治疗神经胶质瘤等[25-30]。

然而大部分实验结果并未达到我们的预期，实体瘤的CAR-T细胞疗法疗效远不及血液系统恶性肿瘤。实体瘤和血液系统恶性肿瘤间存在如下差异：首先，血液肿瘤通常较弥散，而实体瘤在早期即在某一器官或组织内形成较为聚集的团块。其次，血液肿瘤的表面靶抗原较为一致，且大多数恶性细胞都携带有靶抗原；相反，实体瘤表达的抗原异质性较大，不仅不同实体瘤细胞表达的抗原不同，同种实体瘤的不同阶段所表达的抗原也有差异，因此不易找到特异性的靶点。实体瘤周围存在免疫抑制微环境(Immunosup-pressive tumor microenvironment TME)，抑制过继转移的T细胞向病灶内迁移。总之，CAR-T细胞疗法针对实体瘤的治疗技术尚不成熟，仍需进一步的研究及试验。

4 CAR-T细胞疗法在肺癌中的应用

肺癌是全球男性癌症相关死亡的首要原因，是女性癌症死亡的第二大原因[31]。由于缺乏特异性临床表现，多数患者确诊时已属于中晚期。尽管在过去的几十年中，包括手术、化疗、放疗、靶向治疗等综合治疗方法的实施，已在很大程度上改善了患者无病生存期和总生存期，但5年生存率仅19%。随着肿瘤生物学研究的进步，以及对肺癌发病机制的进一步认识，肺癌的免疫治疗近年来应运而生。目前主要有两个研究方向：一是以CTLA-4抗体和PD-1/PD-L1抗体为代表的阻断免疫检查点的封锁疗法，免疫检查点抗体通过解除肿瘤细胞对T细胞的抑制,激活T细胞功能,恢复T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。二是以CAR-T细胞疗法为主的过继细胞免疫疗法。后文将阐述CAR-T细胞治疗肺癌的现状及问题。

5 CAR-T治疗肺癌的主要靶点

5.1内皮生长因子受体EGFR 表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)显著表达于各种实体肿瘤的细胞膜表面，特别是在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)中。EGFR过表达影响肿瘤细胞生长、肿瘤血管生成、以及肿瘤的侵袭和转移。 EGFR作为人类肿瘤诊断和治疗靶点的潜在价值已经被认识了数年。Feng等[32]的实验中观察到11名晚期复发/难治性NSCLC患者在接受抗EGFR CAR-T细胞治疗后均未出现明显毒副反应，2例患者达到部分缓解(PR)，5例患者疾病稳定(SD)期达2～8个月。取PR或SD患者的肿瘤组织活检做免疫组化，结果证实以EGFR为靶点的CAR-T细胞可以浸润肿瘤组织，诱发EGFR特异性细胞毒性。这意味着抗EGFR的CAR-T细胞可以通过TME，发挥免疫杀伤肿瘤细胞的功能。

5.2酪氨酸激酶受体EphA2 Eph是受体酪氨酸激酶(RTKs)家族中最大的一类[33]。EphA2在许多发育过程中起着关键作用，并与许多癌症有关[34]。EphA2在超过90%的非小细胞肺癌中过表达，但在正常肺组织中不表达。研究表明EphA2的过表达与K-RAS基因突变阳性患者的不良预后密切相关[35]。Ning等[36]的研究证明抗EphA2 CAR-T细胞在与EphA2阳性靶标共培养时可通过产生细胞因子IFN-γ引起肿瘤细胞裂解，并且在体外实验证明细胞毒性效应是特异性的。体内实验同样发现以EphA2为靶点的CAR-T细胞的显著抗肿瘤活性。约有15%的肺癌患者在初诊时出现胸腔积液，50%的患者在进展后出现胸腔积液[37,38]。该项研究中指出抗EphA2 CAR-T细胞可以注入胸腔内治疗EphA2阳性的恶性胸腔积液患者，后续的研究已经开始。

5.3黏蛋白1(Mncoprotein，MUC1) MUC1是一种跨膜蛋白,与肿瘤的黏附和转移密切相关。降低肿瘤细胞之间直接黏附，使之脱落种植。同时增强肿瘤细胞与内皮细胞的黏附,介导肿瘤细胞转移[39,40]。MUC1在正常肺组织的表达极低，但肿瘤发生时则显著过表达。Wei等[42]应用NSCLC的PDX小鼠模型证实，以MUC1为靶标的CAR-T细胞对肿瘤细胞有特异性杀伤能力。MUC1可以作为小细胞肺癌免疫治疗的可靠靶点。为目前开展的针对抗MUC1 CAR-T细胞的临床试验(NCT02587689)奠定了基础。

5.4人类表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER2) HER2是肿瘤相关抗原，在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、恶性肿瘤中显著表达。而在正常组织中不表达或极少表达[42]。已有研究证实，抗HER2的CAR-T细胞在HER2阳性的肿瘤患者中有显著的抗肿瘤疗效[43]。为肺癌的治疗提供了新思路，目前国内已开展抗HER2 CAR-T细胞治疗肺癌的临床Ⅰ期研究(NCT02713984)。

5.5间皮素(Mesothelin,MSLN) MSLN是一种细胞表面糖蛋白，在多种实体肿瘤的细胞表面均质表达，但在肺癌和胃癌中，不仅表达细胞表面，也表达于肿瘤细胞的细胞质内。多项抗MSLN CAR-T细胞治疗实体瘤的临床研究正在开展(NCT01583686、NCT02414269、NCT02580747)。Adusumilli等[44]建立了恶性胸膜间皮瘤原位小鼠模型，在这个模型中，给予全身或胸腔局部的抗MSLN CAR-T细胞。胸腔给药组的CAR-T细胞增殖能力、存活能力以及肿瘤细胞杀伤能力高于全身给药组的30倍。抗MSLN CAR-T细胞的胸腔局部应用促进了早期的抗原反应，增加细胞因子分泌，活化免疫相关T细胞。此外，该项实验还发现胸腔内给予的抗MSLN CAR-T细胞可以在体内长期存在，并在杀灭肿瘤细胞后的200 d中持续抑制肿瘤细胞的复发。在这些发现的基础上，一项针对间皮瘤、肺癌和胸膜转移的乳腺癌患者的抗MSLN CAR-T细胞局部Ⅰ期研究已经开展(NCT0241426)。

上述靶点为现有治疗肺癌的主要研究方向，除此之外，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3也被证实是肺鳞状细胞癌CAR-T细胞疗法的新型潜在靶点[45]。随着研究深入会有更多的靶点应用于肺癌的过继细胞疗法中，如KRAS、c-MET、BRAF等。

6 CAR-T治疗肺癌的问题

CAR-T细胞输注后最常见最严重的副作用是细胞因子风暴(Cytokine release syndrome，CRS)。由于嵌合抗原受体与相应的肿瘤相关抗原特异性结合，引发大量细胞因子释放，级联激活多类免疫反应[46]。主要临床表现是高热、高血压、呼吸困难甚至多器官衰竭[47]。David等[48]提出了一种预测CRS的算法，指出输注后第一个月内IFN-γ、IL-6、sgp130和sIL-6R的峰值水平可作为sCRS的标准指标。后续的研究表明，IL-6受体拮抗剂能在不影响CAR-T细胞功能前提下有效地控制CRS[49]。

其次，脱靶效应也是常见的不良反应。理想的CAR-T细胞靶点是在肿瘤细胞中高表达，而在正常组织中不表达或低表达的抗原。脱靶效应指的是CAR-T细胞发挥细胞毒性的过程中识别正常机体的抗原导致机体正常组织器官的损伤。解决脱靶问题，应在寻找更安全的靶点同时，可以通过降低单链抗体的结合力减轻免疫反应[50]，同时应用抑制性CAR，调控CAR-T细胞的活性[51]。为提高CAR-T细胞安全性。研究人员提出了自杀基因疗法，即在CAR-T细胞中引入相关基因，使表达这些修饰基因的细胞会被分泌的细胞毒性物质杀死，进而避免潜在的毒副作用。目前证实效果较好的基因有可诱导性Caspase-9(iC9)、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)以及EGFR阻断基因。其他人工干预CAR-T细胞凋亡途径的研究也正在展开，有望解决相关问题。

肺癌作为实体瘤的一种，存在肿瘤免疫抑制微环境(Tumor microenvironment,TME)，TME影响CAR-T细胞的活化，抑制其杀伤肿瘤的功能。研究人员发现联合应用PD-1/PD L1抗体能有效地解决这一问题[52]。另外，研究人员设计了同时针对VEGF-2及IL-2的CAR-T细胞[53]，能够增强CAR-T细胞浸润至肿瘤组织的能力。

7 展望

近年来，随着对肺癌发生发展机制研究的逐渐深入，推出了许多新的治疗手段。CAR-T细胞疗法作为肺恶性肿瘤治疗，近年来虽然取得了一定进展，但仍有许多问题亟待解决。通过寻找更准确的靶点，进一步明了CAR-T细胞疗法的机制和降低CAR-T细胞疗法所带来的副作用，制定出个体化的治疗方案。有理由相信，CAR-T细胞疗法将会给广大的肺癌患者带来生存上的获益。