内皮-间充质转化在肺动脉高压发病机制中的研究进展*

张静静， 王 岗△， 李满祥

(1西安交通大学第二附属医院急诊科， 陕西 西安 710004； 2西安交通大学第一附属医院呼吸与危重症医学科， 陕西 西安 710061)

肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)是由多种已知和未知原因引起的肺循环血压异常升高的一种病理生理综合症，主要累及心血管及呼吸系统[1-2]。根据2015年最新PH的临床分型，PH分为动脉型肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)、左心疾病所致PH、肺部疾病或缺氧所致PH、慢性血栓栓塞性PH(chronic thromboembolic pulmonary hypertension，CTEPH)和其它不明原因或多种机制导致的PH[3]。其中，PAH又分不同亚型，包括特发性PAH(idiopathic PAH，IPAH)、遗传性PAH(he-ritable PAH，HPAH)、药物和毒物诱导的PAH及疾病(结缔组织病、HIV感染、血吸虫病等)相关性PAH[4]。PAH诊断的金标准是在静息状态下，右心导管测量平均肺动脉压(mean pulmonary artery pressure，mPAP)≥25 mmHg，肺毛细血管楔压(pulmonary artery wedge pressure，PAWP)≤15 mmHg且肺血管阻力(pulmonary vascular resistance，PVR)>3 mmHg的血流动力学状态，同时排除其它临床类型的PH[3]。

尽管不同类型PAH的病因不同，但有很多相似的病理特点，包括进行性外膜和中膜增厚、偏心或向心性内膜增厚、动脉血管闭塞和再通以及丛状病损[5]。内皮细胞(endothelial cell，EC)功能障碍和平滑肌细胞(smooth muscle cell，SMC)增殖导致肺血管重构，使肺血管阻力及肺动脉压力逐渐增加，最终导致进行性右心室功能障碍和患者死亡[5]。众所周知，PAH诊断困难，有效的治疗药物较少。1998年后，针对EC功能紊乱的3大经典途径，即前列环素通路、内皮素1受体通路和一氧化氮通路的靶向药物陆续进入临床，这些药物虽不能根治PAH，但可使PAH患者的1年、3年和5年生存率分别升高12%、27%和30%[6]。

经过近几年的实验研究，人们发现PAH跟肿瘤的发病机制有许多相似之处，如内皮-间充质转化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)在一定程度上也能够导致肺血管重塑，促进PAH的形成。化疗药紫杉醇通过对转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)/骨形态生成蛋白(bone morphogentic protein,BMP)信号通路中FoxO1转录因子的激活作用，最终对EndMT产生抑制作用，现在已经应用于PAH的治疗[7]。针对肺动脉EndMT调控通路的研究对PAH的治疗应该具有一定的指导意义，通过对TGF-β/BMP信号通路的靶向干预也许将成为未来治疗PAH的突破点之一。基于此，本篇主要针对EndMT及其相关信号通路在PAH血管重构中调控机制的研究进展进行阐述，为PAH以后的治疗模式提供新的理论依据。

1 EndMT概述

在胚胎发育阶段和后天受到外界病理性刺激时，内皮细胞从血管腔表面逐渐分离，并迁移到内皮下组织。这种迁移与血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin/CD144)、血小板内皮细胞黏附分子1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)和骨架蛋白(p120-catenin)等膜蛋白诱导的细胞间黏附能力丧失有关。由此内皮细胞获得了迁移和浸润能力，促使它们到达周围组织。而在迁移过程中，内皮细胞丢失了其自身标志物CD31和CD144，而逐渐表达间充质细胞或者成纤维细胞标志物，如α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和波形蛋白(vimentin)，即EndMT[8]。

EndMT属于上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的特殊形式。EMT发生于上皮细胞中，在胚胎发育过程及上皮损害、肿瘤转移等病理变化中也发挥着重要作用[8]。EndMT和EMT的过程都能使细胞获得间充质细胞表型，而且有部分共同的信号传导通路。多家研究机构也在胚胎发育阶段发现内皮细胞有转化为血管平滑肌细胞等间充质细胞的能力[9]。Arciniegas等[9]通过免疫组化的方法观察鸡胚不同发育阶段的血管，发现EndMT过程促进主动脉和肺动脉的发育成熟;利用胶体金标记技术，DeRuiter等[10]的研究结果显示在鹌鹑胚胎血管发育的早期阶段，被标记的内皮细胞可能出现在血管内皮下组织并且表达α-SMA;对人体胚胎血管进行免疫组化和三维重建也证实了以上观点[11]。此外，EndMT也参与多种疾病的病理过程，如心、肾等器官的病理性纤维化[12-14]和致瘤性转化[15]等。目前，EndMT作为一种重要的生理调控和病理改变机制已经受到广泛关注。

2 EndMT参与PAH的形成

内皮细胞屏障的完整性破坏和不断增强的炎症细胞浸润是PAH肺血管重塑的共同病理学特点[16-17]。事实上这些病理变化或多或少以表达α-SMA阳性细胞为特点[18]。可是这些细胞的来源和造成其在病损部位沉积的分子机制目前并没有阐明。过去认为α-SMA阳性细胞来源于常驻血管中膜SMC的去分化以及外膜纤维母细胞的分化，并在此基础上进行增殖与扩张。随着病理生理学研究的不断深入，人们发现肺血管EC能转化为间充质细胞并表达α-SMA，这个过程促进平滑肌样细胞在血管病损部位的累积，造成肺血管重塑，引起PAH[19]。

2002年，Frid等[20]将小牛成熟肺血管EC体外培养，并暴露于慢性压力和炎症因子中6 d左右，发现内皮细胞逐渐转化为间充质细胞或者平滑肌样细胞表型，即VE-cadherin表达明显减少，而α-SMA表达增加，发生了EndMT。2006年，人们在低氧诱导的PAH大鼠模型中发现，受心肌素(myocardin)的调控，肺血管EC能转分化为平滑肌样细胞，并导致肺血管阻力的增加，而用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)抑制心肌素的表达，能抑制此过程的发生[21]。

2015年，在人PAH肺组织动脉内膜和丛状病损部位，Ranchoux等[5]发现肺动脉内皮细胞(pulmonary arterial endothelial cells，PAECs)中同时存在间充质/内皮表型(α-SMA和CD34)及EndMT相关的主要转录因子Twist-1的高表达，这为 EndMT过程参与人体PAH的形成提供了有力证据。同年，Good等[22]通过实验证明炎症因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)联合TGF-β能促进体外培养的人PAECs进行EndMT过程。在这个过程中，PAECs失去了内皮细胞的鹅卵石样结构特征并进行细胞骨架重排，形成跟纤维母细胞形态相似的纺锤体样细胞。这些EndMT细胞(即过渡细胞)呈现间充质细胞标志物的上调(I型胶原蛋白和α-SMA)，以及内皮细胞相关蛋白的下降(CD31和VE-cadherin)。而且这些过渡细胞本身也分泌高水平的促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α，都将加速肺血管重塑的进程和PAH的形成。总之，肺组织在受到低氧、炎症或者野百合碱等毒物刺激时，肺血管内膜发生损害，机体通过一系列调节机制进行组织血管的修复，就可能出现部分PAECs进行间充质转化，导致肺血管重构，最终造成PAH的形成。因此研究EndMT过程的发生机制、调节分子和传导通路，对抑制血管重塑及研发肺血管高压新疗法都至关重要。

3 TGF-β/BMP信号转导通路

随着PAH中EndMT过程研究的不断深入，越来越多的调控分子以及传导通路被发现并研究，TGF-β/BMP通路无疑作为最重要的一条备受关注。其中，TGF-β超家族成员是EndMT过程最常见的诱导因素，其成员主要包括TGF-β、BMP、活化素(activin)和生长分化因子(growth differentiation factor，GDF)等。BMP受体2(BMP receptor 2，BMPR2)是TGF-β超家族受体的一个成员，同时是HPAH最常见的一种基因突变，占到HPAH的70%以上，占到IPAH的10%～40%水平[23]。PAECs可在TGF-β信号的诱导下发生EndMT，但与此同时，EndMT也可以被BMPR2抑制[24-25]。因此本文将主要围绕TGF-β/BMP信号转导通路相关的关键调控分子进行阐述。

3.1BMPR2基因 研究发现，在大鼠PAH模型中，过表达BMPR2基因能减缓肺血管重塑，较少出现右室肥厚和肺血管阻力增加[26]。此外，TGF-β1能诱导体外培养的人PAECs发生EndMT，并引起BMPR2基因表达降低[26]。在野百合碱诱导的PAH动物模型中，TGF-β信号明显增强，但通过腺病毒过表达BMPR2也能一定程度上减轻肺血管阻力，比如实验已经确定的BMPR2活化剂FK506(他克莫司)能有效缓解PAH的症状[27]。正常情况下，BMPR2与活化素受体样激酶(activin receptor-like kinase，ALK)可以形成异二聚体[28]，不同种类的ALK与BMPR2的结合导致不同的配体亲和力，从而在组织中对BMP表现不同的敏感性和结合力。值得注意的是，在人肺组织微血管EC中，BMPR2/ALK-1异二聚体信号对BMP9/10具有相对特异性[29]，而在肺的平滑肌细胞中，BMPR2与ALK-3或ALK-6结合形成的异二聚体信号对BMP2/4具有相对特异性[30]。在与配体结合以后，这3个物质形成的复合物BMPR2/ALK/BMP会导致SMAD蛋白磷酸化，引起核移位，最后通过SMAD结合元件在转录水平上调控细胞增殖、分化和凋亡等过程[31]。

当BMPR2基因突变或者特定外显子碱基对被删除，会出现肺微血管内皮细胞的肌型转化，免疫组化显示Twist-1和磷酸化vimentin过表达，这为EndMT过程的形成提供了证据[5]。有研究表明，即使在无BMPR2基因突变的前提下，PAH患者中BMPR2基因的表达也会降低[32]，说明可能有其它的调控因素同时影响这条传导通路；而且在HPAH中，虽然这种疾病属于常染色体显性遗传，但只有20%的携带者发展为疾病[33]，也说明还有其它的宿主或者环境因素起作用。芳香化酶抑制剂阿那曲唑(anastrozole)、溶酶体酶抑制剂氯喹、紫杉醇(paclitaxel)等或多或少会影响BMPR2/ALK信号通路[7]，但具体的作用靶点还需进一步的研究。

3.2高迁移率族蛋白A1(high mobility group protein A1，HMGA1) 高通量RNA测序分析结果发现IPAH患者PAECs中的染色质结构因子HMGA1较对照组表达增加[34]。HMGA1结合DNA的富AT区域，改变核染色质结构进而影响转录活性，是重要的细胞内结构因子家族成员[35]。通常HMGA1分子高表达在胚胎发育的干细胞中，但在已经分化的组织中表达很低或不表达[36]。在多种肿瘤发生过程中，HMGA1分子的异常升高通过诱导EMT促进其致瘤性转化[15]。这种转变归因于对上皮细胞连接蛋白E-cadherin的抑制和间充质细胞相关基因的上调。

Hopper等[35]假设HMGA1增加也可诱导PAECs转化为平滑肌样间充质表型，即EndMT，进行肺血管重塑，导致PAH。他们利用共聚焦显微镜观察到人肺组织局部HMGA1增加促进PAECs的持续转化，同时确定在闭塞性和致丛性病变部位，许多内膜细胞表现为内皮表型标志物von Willebrand因子(von Willebrand factor, vWF)和间充质表型标志物平滑肌22α(SM22α)双阳性。通过siRNA减少正常人群中的BMPR2表达，观察到HMGA1蛋白的表达也相应增加。这与HMGA1促进PAECs转化相一致，都表现为PECAM-1/CD31减少，而间充质表型标志物增加，即α-SMA、SM22α、 磷酸化vimentin、Slug和Snail蛋白增加。Snail和Slug是与EndMT或EMT密切相关的锌指结构转录因子[37]，Slug和Snail会阻遏VE-cadherin蛋白的基因表达[38]，导致细胞桥粒离解，对于生长因子诱发的EndMT是一个始动和必要的因素[39]。而HMGA2作为和HMGA1紧密相关的蛋白，通过结合启动子和募集SMAD蛋白提高SNAIL基因的转录，直接影响Snail蛋白的表达[40]，即BMPR2基因突变，上调HMGA1基因，导致Slug和Snail蛋白的表达增加，进而促进EndMT过程[35]。

3.3其它调控分子 在细胞膜上，BMPR2能与小窝蛋白1(caveolin-1，CAV1)直接相互作用而抑制血管增殖[41]。其它研究显示在PAH中BMPR2还可以通过磷酸化血清反应因子(serum response factor，SRC)调控CAV1蛋白质的运输，进而抑制血管增殖[42]。伊马替尼(imatinib)作为血小板源性生长因子受体拮抗剂，也能一定程度上缓解EndMT的进程，但其机制尚不明确[43]。此外，细胞的迁移有赖于各种蛋白酶降解细胞外基质，其中基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases，MMP)和丝氨酸蛋白酶家族就能加速EndMT的过程。雷帕霉素或者雷帕霉素类似物在野百合碱导致的PAH模型中能部分抑制EndMT的机制，可能在于雷帕霉素通过诱导VE-cadherin的表达，阻止EC的迁移，阻止 vimentin和Twist-1蛋白的表达，抑制EC MMP-2和MMP-9[44]。

总之，除了TGF-β/BMP这条主要的信号通路外，EndMT还可能涉及其它多种信号通路，而且信号通路之间往往具有交互作用。研究肺动脉高压的发病机制，尤其是EndMT的发生机制，对寻找治疗新靶点，抑制肺血管重塑都有重要意义。