以PRRSV为载体表达外源基因的研究进展

李清清，姚 静，韦祖樟

（广西大学动物科学技术学院，南宁530005）

以PRRSV为载体表达外源基因的研究进展

李清清，姚 静，韦祖樟

（广西大学动物科学技术学院，南宁530005）

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一种以呼吸系统和繁殖障碍为特征的传染病，已被公认为影响全球养猪业的重要经济性疾病。目前，传统的活疫苗免疫是防控猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的主要手段，但该疫苗的安全性和有效性还需进一步提高。本文就对近年来以PRRSV感染性克隆作为工具表达外源基因的重组病毒的研究进展做一综述。

猪繁殖与呼吸综合征病毒；载体；感染性克隆；外源基因

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种以呼吸系统和繁殖障碍为特征的疾病。临床表现主要以妊娠母猪发生流产、木乃伊胎、死胎以及各阶段猪发生呼吸道疾病为特征[1]。此病首先于1987年在美国发现，近30年来已在全世界范围内广泛流行。PRRSV基因的遗传多样性、感染机体的免疫抑制性和持续性使其难以控制[2]。PRRS已被公认为影响养猪业发展的重要疾病。

PRRSV属于动脉炎病毒科（Arteriviridae）、动脉炎病毒属（Arterivirus）。PRRSV分为两个基因型：欧洲1型和北美2型。PRRSV基因组为不分节段，单股正链RNA，全长约为15 kb，基因组5'端有帽子结构和非编码区（UTR），3'端有UTR和poly(A)尾。从5'端到3'端，至少有10个开放阅读框（open reading frame，ORF）[3]。依次分别为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORFs3～7，以及最新发现的ORF5a。占基因组全长3/4的ORF1a和ORF1b编码病毒基因组复制和转录相关的酶复合物，这些酶复合物还在病毒拮抗干扰素过程中起着重要的作用。PRRSV基因组3'端至少有8个ORFs（ORF2～ORF7）来编码病毒结构蛋白。其中，ORF2a、ORF3、ORF4和ORF5分别编码GP2a、GP3、GP4和GP5等囊膜糖蛋白。ORF2b、ORF5a、ORF6和ORF7分别编码非糖基化囊膜E蛋白、ORF5a蛋白、膜基质蛋白M和核衣壳蛋白（Nucleocapsid），也称N蛋白。结构蛋白的表达需要病毒通过5' UTR末端以及结构蛋白编码区域的转录调控序列（transcriptional regulation sequence，TRS）之间的相互作用，采用不连续性转录(discontinuous transcription）方式产生至少6种亚基因mRNA(subgenomic mRNA，sgmRNA)。亚基因组RNA与mRNA1（亦即病毒基因组RNA，vRNA）共享5' UTR、3' UTR及poly(A)尾[4]。

目前，疫苗免疫是防控PRRSV的主要手段。商品化的PRRSV疫苗有灭活苗和弱毒苗。PRRS灭活疫苗保护率低。弱毒疫苗的保护效果比灭活苗好，但不能保护临床感染和排毒，也存在毒力返强的潜在危险，所以研制更加安全、有效的基因工程疫苗是当前研究的热点。基于反向遗传操作基础上构建的PRRSV活病毒载体疫苗是未来PRRSV疫苗的研发方向之一。本文对以PRRSV为载体，通过缺失病毒复制非必须的基因以及插入外源病毒保护性抗原，构建重组PRRSV疫苗或基因缺失疫苗的研究进展情况做一综述，探讨其作为高效新型PRRS疫苗的可行性。

1 NSP2非必需区域插入外源基因的研究进展

nsp2是PRRSV变异最大的非结构蛋白。nsp2编码基因全长可达3500 nt。不同基因型毒株nsp2同源性仅为30%，相同基因型毒株nsp2同源性最高也只有60%[5]。nsp2高变区域常发生外源基因的插入、基因片段的缺失、碱基序列的变异。特别是nsp2高变区基因缺失最为常见，比如我国分离代表性毒株HuB、JXA1以及来自美国的MN184的nsp2基因编码区均含有不同大小氨基酸的缺失。而在PRRSV细胞传代的过程中，nsp2高变区氨基酸也易缺失。在MARC-145细胞中反复传代后，PRRSV TJ株和JX143株的nsp高变区分别出现120 aa和88 aa的缺失。Eric A.Nelson[6]在PRRSV感染性克隆（VR2332）的基础上，将PRRSV nsp2高变区部分氨基酸进行人为缺失，发现nsp2能够耐受432 aa的缺失。在其它PRRSV毒株的感染性克隆的基础上对nsp2高变区进行缺失，也发现nsp2能够缺失[7]。这些研究结果说明nsp2是一个理想的外源基因插入位点。PRRSV nsp2属于免疫显性蛋白，有较强的免疫原性。PRRSV感染的猪体可在1～2周内产生较高的针对nsp2的抗体。对非必须区的免疫抗原表位进行缺失，有利于构建基因组缺失标识疫苗。Ying Fang[8]用北美1型PRRSV野毒株（SD01～08）构建的全长感染性克隆的基础上，缺失nsp2中的一个免疫性表位ES4，在其nsp2区域插入绿色荧光蛋白基因，拯救的重组病毒的细胞中能看到GFP的表达。将重组病毒感染猪后，可用ELISA方法检测将重组病毒和亲本病毒进行区分。结果表明，表位ES4缺失并同时表达GFP的重组病毒可以作为一种潜在标记疫苗。然而，在MARC-145细胞中连续传至8代后，重组病毒的GFP基因开始逐渐缺失。采取同样的策略，在北美2型PRRSV的感染性克隆（FL12）的基础上，在PRRSV的nsp2基因高变区插入GPF基因，拯救的重组病毒能够在细胞中表达GFP蛋白[9]。在PRRSV 2型原型毒株VR-2332感染性克隆的基础上，对nsp2高变区进行缺失，并在缺失的位点插入FGP基因。发现重组病毒能产生荧光，但是重组病毒的插入位点不稳定，随着病毒的传代，荧光逐渐消失[10]。有趣的是，在疫苗株PRRSV感染性cDNA克隆（HuN4 -F112）基础上，其nsp2区域缺少25氨基酸，在这缺失位点中插入一段编码新城疫病毒核蛋白（NDV-NP）B细胞抗原表位的基因。拯救的病毒在细胞中连续培养至20代，通过间接免疫荧光和基因组测序的方法可鉴定出插入的NDV-NP能够稳定表达。将拯救的重组疫苗病毒接种猪只，可检测其血清得到该重组病毒包含NDV-NP特异的抗体，且血清中不含有缺失的25氨基酸抗体，说明该重组疫苗株可作为潜在的标识疫苗[11]。

总之，NSP2中间高变区含有对病毒复制的非必需区域，是较为理想的外源基因插入位点。nsp2免疫原性很强，含有较多的抗原表位，可将病毒复制非必需的免疫原性的表位缺失，是构建基因缺失疫苗的理想位点。但一些研究表明，nsp2高变区的某些位点插入外源基因具有不稳定性，一定程度上影响了其作为重组疫苗插入位点的理想靶标。nsp2的遗传多变，重组病毒缺失的nsp2免疫原性表位也可能存在于nsp2自然缺失的野毒株中，这在一定程度上影响标识疫苗的研发。

2 ORF1和ORF2之间插入外源基因的研究进展

相邻ORFs之间存在一定数量的重叠序列是PRRSV基因组的一个特点，特别是在ORF2、ORF3和ORF4之间，重叠序列可达到100 nt以上。PRRSV基因排列的复杂性，增加了对PRRSV进行遗传操作难度。特别的是，编码非结构蛋白的ORF1b和编码GP2a蛋白的ORF2之间并无重叠序列，两者之间相差1个核苷酸，这一特性使得该位置成为研究外源基因插入的关键性突破口。

在北美PRRS毒株P129感染性克隆的基础上，在ORF1a和ORF2a中插入两个独特的限制性酶切位点和转录调控序列6（TRS6），将EGFP和圆环病毒Ⅱ型（PCV2）的衣壳蛋白（Cap）编码基因分别插在TRS6之后，使得GFP和PCV2 Cap蛋白以独立亚基因组单元进行转录和表达。拯救的重组病毒在细胞上能够稳定传37代。将拯救的重组病毒接种猪只，用ELISA检测接种猪只5周后的血清，能够检测到GFP基因和PCV2衣壳基因的特异的抗体[12]。这些研究表明表达的外源蛋白具有良好的免疫原性，该重组病毒可作为一种可能的多价疫苗。使用同一感染性克隆，Yongming Sang[13,14]等在PRRSV的ORF1b和ORF2之间插入一系列外源基因（海肾荧光素基因、虫荧光素蛋白基因、红色、绿色荧光蛋白基因、I型干扰素基因）。除了携带虫荧光素基因的重组质粒未能拯救出重组病毒之外，其它重组质粒均能够拯救出重组病毒。有意思的是，表达干扰素的重组病毒感染细胞后能释放出有活性的干扰素，激活细胞的抗病毒通路，对共感染或者二次感染的PRRSV均有抑制的作用。重组病毒分泌的干扰素同样对重组病毒产生抑制，尽管重组病毒能够在细胞中稳定存在，但病毒只能以较低的滴度复制，这降低了其作为重组疫苗的潜在价值。在经典株PRRSV感染性克隆（APRRSV）的基础上，在ORF1b和ORF2a中插入PCV2的衣壳蛋白（Cap），使PCV2 Cap蛋白以独立亚基因组单元进行转录和表达。可惜的是，拯救的重组病毒携带的Cap基因在传代的过程中逐渐缺失。进一步研究发现，病毒在亚基因组转录的过程中，病毒能够利用外源基因PCV Cap基因中的TRS或ORF2下游的潜在类TRS序列（cryptic TRS-like）产生新的亚基因组[15]。这是否是导致插入的外源序列不稳定的因素还需进一步研究。在疫苗毒株感染性克隆（HuN4-112）的基础上，在ORF1b和ORF2之间插入猪瘟疫苗毒C株的E2基因、集落刺激因子（GM-CSF）和海肾荧光素基因。拯救的重组病毒在细胞内稳定，且重组的外源蛋白在体内有着相应的活性。表达 GM-CSF重组病毒体内能够激活骨髓源单核树突状细胞和提高细胞因子的免疫应答[16,17]，这些研究为增强机体的免疫应答和提高疫苗的免疫效率以及为研制PRRS-CSF多价重组疫苗提供了坚实的基础。在PRRSV的ORF2a/b引入一个额外的转录单元也可降低病毒的毒力。在HPPRRSV毒株中的ORF2a/b位置插入一个含有表达GFP基因的转录调控序列TRS6[18]，将重组病毒与亲本病毒比较，重组病毒在细胞中增殖较慢，猪只感染重组病毒后，存活下来的临床症状表现轻微甚至无临床症状。

以上的研究表明，ORF1和ORF2之前插入单独的转录调控元件，使得外源基因单独作为一个亚基组进行转录和表达。该位点容纳外源基因较大、重组病毒遗传稳定，且外源蛋白具有相应的生物学活性，是一个理想的外源基因插入位点。但是，也有个别研究报道发现，使用同样的方法在该位点插入相同的外源基因，拯救不出重组病毒或某些重组病毒在传代过程中出现外源基因缺失的现象，这可能与PRRSV毒株间的差异有关。

3 ORF7和3' UTR之间插入外源基因的研究进展

ORF7编码病毒的核衣壳蛋白N紧邻3' UTR。研究表明，在3' UTR中，紧随ORF7终止密码子之后的40 nt对于病毒的活性是非必需的。将基因1型PRRSV毒株3' UTR替换2型基因毒株中，嵌合cDNA克隆，仍然可以成功拯救出嵌合病毒[19]。说明尽管两者的3' UTR一级核苷酸序列差异大，但是它们之间具有包含类似功能的高级结构，而且2型PRRSV N蛋白C端可以缺失4个氨基酸，其活性不会受到影响[20]。这些研究结果初步表明ORF7末端和3' UTR起始端可进行一定数量核苷酸的缺失。在PRRSV疫苗株感染性克隆（CH-1R）的基础上，在N蛋白编码区和3' UTR插入一个TRS6，并插入GFP基因或白细胞介素4（IL-4）。拯救的重组病毒在细胞传代过程中保持稳定。将重组病毒免疫猪，发现重组病毒免疫猪比亲本毒株免疫猪血液中的双阳（CD4+CD8+）T细胞和IL-4水平要高，但它却不能显著提高PRRSV疫苗的保护效力[21]。运用相同的方法，他们也曾在N蛋白编码区和3' UTR插入一个集落刺激因子（GM-CSF）。重组病毒免疫猪血液中的双阳（CD4+CD8+）T细胞和IL-4也同样不能提高其保护效力[22]。从这些研究情况看，ORF7和3' UTR之间是较为理想的外源基因插入位点，但还需进一步研究此位点能够容纳的外源片段的大小以及外源蛋白的表达活性的情况。

4 展望

目前商品化的PRRSV疫苗有灭活疫苗和弱毒活疫苗。灭活疫苗效果不明显，弱毒活疫苗对异源毒株保护性差，免疫后出现毒力返强等问题也屡有报道。活疫苗无法与野毒株进行区分，使得该病难以净化。为了克服灭活疫苗和弱毒活疫苗的缺陷，研究者们将把焦点放在研发安全有效的新型基因工程疫苗上。随着反向遗传操作技术不断进步，通过研究PRRSV的一系列与毒力相关的位点以及合适的外源基因的插入位点，针对性地对病毒进行有效的改造，都有可能获得理想的重组病毒，用来研制新型的基因工程疫苗。

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THE RESEARCH PROGRESS ON EXPRESSION OF FOREIGN GENE BASED ON THE PRRSV INFECTIOUS CLONE

LI Qing-qing, YAO Jing, WEI Zu-zhang

(College of Animal Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530005, China)

Porcine reproductive and respiratory syndrome characterized by respiratory and reproductive disorders in piglets and sows has spread worldwide and become the most economically signi fi cant disease. Immunization with live attenuated vaccines is the primary method for the prevention and control of PRRSV. However, the safety and efficacy of the live vaccines need further improved. This review summarizes progress of expression of foreign genes using infectious cDNA clone of PRRSV.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus; vector; infectious clone; foreign gene

S852.659.6

A

1674-6422（2018）01-0089-05

2017-02-21

国家自然科学基金项目（31372444，31660716）；广西自然科学基金项目（2016GXNSFAA380159）

李清清，女，硕士研究生，预防兽医学专业

韦祖樟，E-mail：zuzhangwei@163.com