非编码RNA在神经系统发育和损伤修复中的研究进展

傅 愉 综述， 张 敬 审校

(同济大学生命科学与技术学院分子生物学开放实验室，上海 200092)

随着基因组高通量测序技术的发展，发现ncRNAs种类繁多，长度差异大且不局限于是否剪切、是否为线状结构、是否具有polyA尾。

ncRNAs在中枢神经系统中含量丰富，对神经系统的发育和再生具有重要作用。研究发现，ncRNAs可在转录水平及转录后水平对基因表达进行调控，继而影响神经干细胞(neutral stem cell， NSC)向神经元的定向分化，以及随后的突触和髓鞘发生等。神经元是神经系统的重要组分，这暗示着ncRNAs与中枢神经系统(central nervous system, CNS)之间具有一定的相关性。

ncRNAs与神经系统相关疾病的发生发展关系密切，不仅可以作为神经系统疾病发生发展的生物标记物，还可以诱导神经再生[2-3]。随着干细胞治疗的兴起，ncRNAs用于神经系统疾病的研究与治疗受到了广泛关注[4-5]。

1 非编码RNA的合成与功能

ncRNAs种类繁多，主要包括微小RNA(miRNAs)、长链非编码RNA(lncRNAs)和环状RNA(creRNA)等，目前研究较多的是miRNAs和lncRNAs。miRNAs高度保守，长度在22个核苷酸(nt)左右，其中有2～8nt的种子区可以通过碱基互补配对识别目标mRNA。miRNA的生物合成过程主要包括形成、裂解、转运、剪切、单链降解这五个关键阶段。pri-miRNA为miRNA的前体，在细胞核内产生，长度为300～1000个碱基之后被RNase Ⅲ酶Drosha/DGCR8裂解产生短发夹茎环结构pre-miRNA，通过5-RanGTP转运到细胞质。随后，通过细胞质中的核糖核酸酶Ⅲ酶Dicer将pre-miRNA剪切为20～25个核苷酸大小的成熟双链miRNA，其中一条链被降解，由此形成成熟的单链miRNA。而lncRNAs长度大于200 nt，具有5’末端甲基鸟苷帽式结构和polyA尾，与mRNA结构相似，但缺乏可延伸的开放阅读框，相比于miRNA，lncRNAs的形成过程更为多元，不仅可由编码蛋白的基因断裂形成，也可由染色质重组、非编码基因反义移位产生。

ncRNAs的功能集中在调控作用，miRNA的调控作用发生在转录后水平，lncRNAs可在转录及转录后水平进行调控。miRNA与Argonaute蛋白家族成员结合生成RNA诱导沉默复合物(RNA induced silence complex, RISC)，结合到靶基因的mRNA的3’非翻译区，导致其翻译抑制或降解，从而负调节基因的表达。同样地，相关lncRNA结构分析研究发现，lncRNAs可与多梳复合物、转录因子和染色质修饰因子等关键表观调控元件联合作用，引起下游信号通路的改变，进一步调节干细胞、脑发育及神经系统疾病。

2 非编码RNA与神经系统发育

研究发现，许多ncRNAs可在CNS区特异性高表达，如miR-9、miR-124、lncRNA AK048794等，这暗示了ncRNAs在神经系统发育中的重要作用。

神经系统发育离不开神经干细胞(neural stem cell, NSCs)。神经干细胞是神经系统中一类既具有多向分化潜能又可进行自我更新的细胞，可分化形成神经元和神经胶质两大重要神经系统组分。NSCs向神经元分化主要有三个过程，包括NSCs增殖、神经分化和神经成熟，而这几个过程都可以受到ncRNAs的影响。

ncRNAs可以调控NSCs增殖过程。众所周知，哺乳动物CNS区中NSCs的数量稳定至关重要。NSCs的缺乏可能引起人体的发育障碍，但NSCs的不断增殖，不退出细胞分裂周期，则无法分化形成神经元，同样会产生发育障碍。已有实验证明，let-7b、miR-124，miR-9，miR-134和miR-137等miRNAs可以通过靶向不同的靶基因，调控NSCs的增殖和凋亡。ncRNAs调控NSCs的增殖过程，从而保证了NSCs的稳定输出[8-9]。

ncRNAs也可以调控NSCs向神经元的分化。在神经分化过程中，NSCs可通过对称分裂产生两个NSCs或两个祖细胞，或不对称分裂产生一个干细胞和一个祖细胞[10]。神经祖细胞(neural progenitor cells, NP)会进一步分化为神经元(neuron)，所以神经元分化形成的过程依赖于ncRNA的精确调控。有研究证明，当小鼠的多巴胺能神经元中缺乏miRNA合成关键酶Dicer时，只能分化出比正常形态尺寸更小的神经元，甚至会使小鼠脑组织小于正常脑组织，这暗示了miRNA对神经的分化具有重要的调控作用[11]。如let-7b、miR-9、miR-124在神经干细胞向神经元分化的过程中，其表达水平逐渐上调，提示这些miRNA有利于神经的发生[8-9]。而miR-124可通过靶向结合多个已证实的、与NSCs分化相关的基因，如PTBP1、SOX9、Ezh2等，进而影响神经干细胞的分化[9,12]。同时，lncRNAs也对神经分化有影响，例如在小鼠神经发育过程中，lncRNA Pnky、LncRNA Paupar的敲低都会导致小鼠脑皮质神经分化的增强[13-14]。

ncRNAs还可以调控神经元的成熟过程。目前研究表明，神经元形成主要发生在哺乳动物CNS区的海马齿状回(DG)的亚粒细胞区(SGZ)、侧脑室的室下区(SVZ)和下丘脑[10]。之后进入神经成熟期，即已分化的神经元通过rostral迁移流(RMS)迁移到嗅球变成中间神经元[15]。因此神经成熟期主要包括了神经元迁移，突触形成与髓鞘发生这三个过程，而ncRNAs与这些生物过程息息相关。研究发现miR-134和miR-9可以影响神经元迁移[16]，miR-138、miR-137、miR-132则可以影响鼠的突触形成[17-18]。而有关lncRNAs的研究也发现，lncRNA MSNP1AS过表达后神经轴突数量出现减少，而缺乏lncRNA Evf2突触生长则可受到抑制。另外，lncOL1、Six3os也能影响少突胶质细胞的生成，从而影响髓鞘的发生[3,19]。

不仅如此，随着研究深入，发现ncRNAs对神经发育的过程亦至关重要。ncRNAs在神经外胚层分化、神经元胶质细胞命运决定和神经元表观遗传印记等方面也发挥着重要的调控作用[20]。

3 非编码RNA与神经损伤修复

神经损伤包括创伤性中枢系统损伤(Traumatic brain injury, TBI)和非创伤性中枢系统损伤。常见的病症有脑卒中、阿尔兹海默症、帕金森综合征及其他神经退行性疾病等。神经系统疾病发生后出现的病理变化之一是神经元变性。因此，在神经系统疾病发生后对神经细胞的修复与再生显得尤为重要。

3.1 非编码RNA与神经疾病诊断

ncRNAs不仅与神经再生相关，甚至可以作为一些神经急性损伤或者神经退行性疾病的潜在生物标记物，如惊厥性发作、重性抑郁障碍、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默病等[21]。例如，创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)患者的病情无论属于轻度还是重度，其血浆中miR-16和miR-92a的表达量均高于正常人。除此之外，对于在缺血性脑卒中(Ischemic Injury, IS)这种疾病，分别在患者的外周血中和在该病的动物模型I/R大鼠中发现，miR-34a-5p，Lnc RNA C2dat1的表达水平异常升高，可作为该病诊断的生物标志物之一[22-23]。

3.2 非编码RNA与神经疾病治疗

目前，ncRNAs参与的神经干疗法已经在动物模型水平表现出治疗效果，研究发现抑制神经元细胞凋亡，以及诱导新的成神经再生是治疗的两个关键点。

ncRNAs调控神经元细胞的凋亡的研究进展表明，lncRNAs-N1LR和miR-592的表达上调减少神经细胞凋亡[24]，暗示了对IS小鼠的神经保护作用，所以目前一种看法认为ncRNAs可以通过抑制神经元凋亡从而作为神经系统疾病的潜在治疗候选物。

ncRNAs在调节神经再生方面也有关键作用。正如目前已证实的miR-124、miR-137、miR-184与神经再生直接相关，因此具有可观的临床治疗前景[25-26]。此外，新生神经元的进一步成熟也受到ncRNA的调控。miR-433、lnc SCIR1和lncRNA MSNP1AS都可以通过靶向突触形成关键基因，例如α-突触核蛋白或者骨骼的表达形态发生蛋白7(BMP7)等，从而影响突触形成[27]。甚至还有研究发现没有miR-9活性的hNPC移植到胚胎期小鼠大脑或成年小鼠脑中风模型的脑组织中，可增强神经元迁移能力[28]。所以，ncRNAs可以通过刺激神经再生途径作为神经系统疾病的潜在治疗候选物。

3.3 非编码RNA与神经疾病预后分析

ncRNAs的表达量具有时空特异性暗示了ncRNAs在分析神经疾病预后中的作用。血清中Let-7e在缺血性卒中发生发展不同阶段呈现出不同的表达水平，在IS患者的恢复期表达水平最低，而在急性期表达水平最高。然而，IS患者血清中的miR-338表达量在任何阶段都没有显著差异[29]。因此，miR-338和Let-7e表达量的变化情况可为IS患者的预后分析提供参考数据。不仅如此，通过对脊髓损伤小鼠模型的(spinal cord injury, SCI)血清进行miRNA分析显示，miR-9*(编码miR-9的所有三种初级转录物之一，表达量略低于miR-9)，miR-219和miR-384-5p与SCI严重程度相关[27,30]。据相关学者全基因组芯片分析发现，通过比对阿尔茨海默症(AD)小鼠与wt小鼠，找到了一组差异表达的lnc RNAs，如Nudt19，Arl16，Aph1b等，这些均可作为AD样神经退行性早期和晚期阶段的潜在生物标志物。因此，ncRNAs的变化量有助于分析患者病情并评价治疗效果。

神经再生为CNS损伤或神经退行性疾病的治疗提供了这样一种可能性： 在不久的将来，我们可使用细胞替代疗法用以修复变性损伤的神经元。成人CNS的许多不同区域中具有产生新神经元潜力的干细胞，暗示了内源性神经干细胞可以用于替换神经退行性疾病中神经元的可能性，并且诱导神经元发育的过程可以在成人CNS的某些区域重现，使得具备功能性的新神经元与现有神经网络相整合。不足的是，一般认为在正常生理条件下成人CNS区域中的神经再生非常有限，这提示了人为诱导神经再生的重要性。

因此，基于ncRNAs具有诱导内源性神经再生的特性，其作为一种治疗CNS损伤或神经退行性病变发的新思路被正式提出。

4 展 望

ncRNAs是细胞中一类不编码蛋白质的分子，包括miRNAs、lncRNAs等。ncRNAs和其靶基因通过表观遗传因子和转录因子等进行相互作用，从而影响NSCs的命运决定，进而对CNS发挥正常功能以及损伤后神经再生进行调控。神经系统疾病发生后，ncRNAs在病理诊断、临床治疗以及病情预后分析等方面都有重要作用[30]。目前关于ncRNAs的研究正在逐渐深入并走向临床，例如有部分学者倾向于研究ncRNAs与表观因子和转录因子的具体作用位点，从而更深刻地了解ncRNAs发挥调控作用的具体机制。另一方面，临床上也在探究ncRNAs与药物联合治疗的相互作用关系，试图为临床治疗开辟新的途径。而目前，包括药物、手术治疗、介入等神经疾病的传统治疗手段的最终效果仍不尽人意，因此针对神经系统的神经干细胞疗法正在逐渐兴起，其中ncRNAs正扮演着重要角色。ncRNAs调控神经元形成的根本机制正逐渐被大家熟知，但目前对中枢神经系统中ncRNAs的研究还处于初步阶段，例如近年来发现的一种新的ncRNA，即环状RNA(circRNA)，它可以通过与miRNA、lncRNAs等竞争性地结合相同的mRNA从而发挥其调控作用。近年发现miRNA自身也会发生甲基化[31]，这说明调控者本身也受到修饰。这些新发现在神经元的形成、神经系统疾病中又扮演着怎样的角色，这个问题还亟待进一步的研究。随着研究的继续深入，精准医疗也进入到大数据时代。目前日益发展的全基因组水平的测序和RNA-seq，RNA CaptureSeq和ChIP-seq等生物信息学分析方法，将有助于提高我们对中枢神经系统发育以及神经系统疾病的认识，为今后的临床治疗提供新的思路。综上，深入研究神经系统中ncRNAs的功能和作用机制，将加强我们对神经系统发育、功能及疾病的认识，同时也可为某些治疗药物的设计与研发提供新的思路。在精准医学的大背景下，我们有理由相信： 当ncRNAs这一类小分子的作用位点，作用机制等关键点被系统性地认知之后，它们将可真正的被运用于临床。