I型遗传性酪氨酸血症动物模型研究进展

顾 鹏，刘 闻，袁 进，徐名衬，陈傍柱，徐 涛，顾为望*

(1.南方医科大学比较医学研究所暨实验动物中心，广州 510515；2.东莞松山湖明珠实验动物科技有限公司，广东 东莞 523808)

I型遗传性酪氨酸血症(HT1)是一种常染色体隐形遗传病，临床上主要变现为严重的肝、肾损伤，甚至肝癌[1]。HT1患者肝中基因表达的改变是导致该病发病的原因，通过基因表达分析可以更好地了解该疾病的具体发病机制。然而，受到伦理道德的限制，很多研究无法直接在人体中进行，必须首先依靠动物模型进行广泛的实验评估和论证。因此，建立可靠地实验动物模型将更有助研究人员认识该疾病本质及其相关的治疗方法。为此，本文对I型遗传性酪氨酸血症动物模型的相关研究进展进行综述和探讨，为更好的研究该疾病提供一些线索。

1 I型遗传性酪氨酸血症临床表现及致病机制

I型遗传性酪氨酸血症又称肝肾性酪氨酸血症，总体患病约为1/2000～1/100000[2-3]。根据I型遗传性酪氨酸血症患者发病年龄，临床上将该疾病分为急性型(发病年龄 < 2个月)、亚急性型(发病年龄2～6个月)和慢性型(发病年龄 > 6个月)[4]。急性患儿多在出生后2个月内急性发病，病情迅速恶化，常在出生后第3～9月死于肝功能衰竭[5-6]。亚急性型与急性型相似，但症状出现在出生后2～6个月之间。慢性型发病时间通常在出生6个月之后，临床表现以渐进性肝和肾损害为主，随着病情的发展最终会导致肝硬化和Fanconi综合征，甚至出现佝偻病[7]。I型遗传性酪氨酸血症(HT1)发病原因是由于患者体内缺乏延胡索酰乙酰乙酸水解酶所致。FAH酶是酪氨酸代谢分解途径的最后一步所需的酶，可将延胡索酸乙酰乙酸(fumarylacetoacetate，FAA)水解为富马酸酯(fumarate)和乙酰乙酸(acetoacetate)[8]。FAH酶缺乏会导致有毒代谢物的积累，包括延胡索酰乙酰乙酸(FAA)和马来酸乙酰乙酸(maleylacetoacetate)。由于其上游代谢物酪氨酸(tyrosine)、4-羟基苯丙酮酸(4-hydroxyphenylpyruvate)含量升高，使中间代谢产物马来酰乙酰乙酸进一步积累，从而刺激产生旁代谢通路，导致其代谢产物琥珀酰乙酰乙酸(succinylacetoacetate)、琥珀酰丙酮增高(succinylacetone, SA)[9]。这两种旁代谢产物可以与蛋白质的巯基结合，是造成肝、肾损害的主要原因。当不接受治疗时，大多数HT1患者在婴儿早期就会死于急性严重肝肾功能衰竭[7]。

2 I型遗传性酪氨酸血症小鼠模型

FAH基因在哺乳动物中非常保守，人、猪、大鼠和小鼠的cDNA(80%同源性)及蛋白质(94%同源性)均有着高度同源性[6]。Fah基因缺陷小鼠最先报导作为研究人类HT1疾病的动物模型并可以通过尼替西农(NTBC)给药进行维持治疗。停药后，该小鼠会发生渐进性肝衰竭和肾小管功能障碍。

1979年Gluecksohn、Russell等[10-11]报导了c14CoS小鼠，该小鼠由于辐射造成了7号染色体大片段的删除。纯合的c14CoS小鼠在出生后数小时内死亡同时伴有严重的肝损伤。研究发现，该小鼠体内许多肝特异性酶都有减少甚至消失，包括酪氨酸氨基转移酶(Tat)[12]、葡萄糖-6-磷酸酶(G-6P)[10]、谷氨酰胺合成酶(Gs)[9]、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(Pepck)[13]、醛缩酶B和血清白蛋白[14-15]等。相反，导致肝损伤的mRNA水平(Chop-1、Nmo-1)则都有上升[16-17]。肝、肾组织学上的损伤在c14CoS小鼠也有发现。但是，由于该小鼠的突变类型是大片段的基因删除，导致例如酪氨酸激酶在内的很多基因也被删除了，因此与人类HT1患者的基因型表现存在一定的差异性。

1993年Grompe等[18]通过同源重组技术将小鼠Fah基因5号外显子删除，成功制备了Fah基因敲除小鼠(FahΔexon5mouse)并显示出与c14CoS小鼠完全相同的表型。此后Overturf (1996)、Paulk (2010)、Lisowski (2012)、Huang(2011)、Zhu(2014)等先后制备了Fah基因敲除的小鼠模型[19-23]。Fah基因敲除小鼠往往会在新生仔鼠出生后1周内死于严重肝损伤，但是通过在水中添加NTBC可以有效改善肝的损伤。NTBC撤药后若继续给予正常蛋白质含量的饮食将会导致严重的肝、肾疾病，通常6周后即会死亡[24]。目前，Fah-/-小鼠已经成为研究I型遗传性酪氨酸血症理想的动物模型。2001年Aponte等[25]人通过ENU诱导制备了Fah基因点突变小鼠。这种单一碱基改变扰乱了核苷酸的剪接并产生一个编码无效蛋白质的等位基因。因此，该小鼠生化表型与其他Fah-/-突变动物一样[20]。

2007年，Azuma等[26]将Fah-/-小鼠和Rag2-/-/Il-2rg-/-小鼠杂交获得FRG(Fah-/-/Rag2-/-/Il-2rg-/-)小鼠，这为之后将人肝细胞移植到免疫缺陷的Fah-/-小鼠上实现肝脏的人源化奠定了基础。但该方法须要进行多次杂交和回交，费时费力。近年来兴起的锌指蛋白酶(ZFN)、TALEN、CRISPR/Cas9 等基因编辑技术可以直接在受精卵中进行基因编辑而受到广泛关注。Winer 等[27]利用锌指蛋白酶将NODRag1-/-/Il2rg-/-(NRG)小鼠受精卵的Fah基因5号外显子敲除，获得的小鼠与Fah-/-小鼠和NRG小鼠杂交得到的FRG小鼠相比，人源肝细胞再植率几乎相同；Li等[28]应用CRISPR/Cas9技术也实现了NRG小鼠中Fah基因的敲除，而耗时仅需6周，相比于传统方法操作更为简单，耗时更短。尽管如此，Fah基因敲除小鼠模型无法反映HT1患者关键的慢性病变，即肝纤维化和肝硬化[29]。

3 I型遗传性酪氨酸血症大鼠模型

作为实验动物模型，在各种生理和病理方面，大鼠比小鼠更接近人类。大鼠体重比小鼠大至少10倍，能够提供的血液、胆汁酸、细胞和组织也更多，对于后续实验分析更为有利[30]。

2016年Zhang等[30]通过CRISPR/Cas9技术成功制备了Fah基因敲除大鼠。Fah-/-大鼠在NTBC停止给药后出现体重下降，进而死于渐进性肝衰竭等其他并发症，表现出与人类HT1患者常见症状相似的特征。相比于Fah-/-基因敲除小鼠，Fah-/-大鼠在NTBC停药后血清ALT，AST和TBIL水平更高，组织学分析也发现大量肝细胞死亡，这表明Fah-/-大鼠具有更严重的肝损伤现象[25,31]。此外，在NTBC停止给药后，Fah-/-大鼠也检测到肾小管损伤。与Fah基因突变小鼠不同，通过肝的宏观变化，组织学分析和生化检查发现Fah基因敲除的大鼠具有明显的肝纤维化和肝硬化表型。

同年，Kuijk等[32]报导Fah-/-/Il2rg-/-大鼠模型可以用于评估体内大鼠肝干细胞的功能。同时也证明了大鼠肝干细胞系特别适用于研究人类代谢紊乱大鼠模型，例如Gunn大鼠(CN综合征型I型)，Fah-/-模型(酪氨酸血症型I型)，血色素沉着症模型以及Long Evans Cinnamon大鼠(威尔森氏病的模型)[33-35]。受益于大鼠肝干细胞系，这些模型将作为潜在的工具进一步阐明这些疾病的分子机制以及检查肝干细胞在移植后恢复肝功能的能力。

4 I型遗传性酪氨酸血症兔模型

目前，酪氨酸血症I型小鼠和大鼠模型均已受到广泛的重视和应用。但是受限于啮齿类动物大小、体型、生理及遗传发育等与人类的差异性，因此一定程度上不能完全反应人类HT1疾病的本质。实验兔作为中等动物模型，生理结构、遗传代谢以及发育上更加接近人类，且具有更长的寿命[36-37]。Fah-/-兔模型的建立可以为HT1肝损伤疾病的机理研究和治疗提供更为可靠的模型。

2017年，Li等[38]通过TALENs基因打靶技术获得了Fah双等位基因敲除兔。Fah-/-基因敲除兔表现出HT1患者肝和肾损伤表型，但也有频繁的眼部病变表型(主要是角膜炎)。这就使得其成为研究如何预防和治疗HT1患者潜在并发眼部疾病良好的模型[39-40]。此外，从DNA水平、蛋白表达水平，血液生理生化水平以及病理变化等方面检测结果显示，与小鼠相比，Fah-/-兔更好的模拟了人类HT1疾病的表型。通过同种异体肝细胞移植发现，移植3个月后外源性肝细胞在Fah-/-兔模型肝脏中整合率达到80%，有效缓解了Fah-/-基因敲除兔的肝损伤，治疗效果明显[38]。

5 I型遗传性酪氨酸血症小型猪模型

小型猪体型大小、生理学、疾病发展等方面与人相似性更大，是生物医学研究中理想的实验动物模型，在探究人类疾病的预防措施、致病机制、治疗效果、药物筛选以及探索人类生命活动规律等方面均更有优势[41]。小型猪的解剖学特征比小型动物模型更接近人类，利用小型猪制备动物模型不仅更能模拟人类疾病的发生发展，而且手术操作更为宏观简单[42]。此外，小型猪器官的大小也使他们成为生产人类细胞、组织甚至异种器官移植最理想的选择[43-44]。

2011年，Hickey等[29]通过腺相关病毒(AAV)和同源重组技术靶向破坏猪7号染色体Fah基因成功制备了Fah基因敲除杂合子猪(Fah+/-)。通过AAV载体打靶猪胎儿成纤维细胞5号外显子，平均敲除效率达到5.4%。这些Fah基因敲除杂合子猪表型正常，具有良好的繁殖能力，突变的等位基因能够稳定遗传，同时肝脏病理学没有任何异常。虽然是杂合敲除，但是Fah杂合子猪的FAH蛋白水平和水解延胡索酰乙酰乙酸(FAA)的能力显著降低。2014年，Hickey等[45]将Fah基因敲除杂合子猪进行互交，成功培育了Fah-/-双等位基因敲除纯合子猪。研究发现，与HT1患者相似，如停止NTBC给药时Fah-/-基因敲除纯合子猪无法发育。其次，由于Fah酶缺乏，Fah-/-基因敲除纯合子猪血液和尿液中酪氨酸和琥珀酰丙酮含量显著上升。Fah酶缺陷导致延胡索酰乙酰乙酸(FAA)在细胞中积聚引起严重的肝损伤[46-47]。生化检测发现血液中AST，碱性磷酸酶，氨和总胆红素显著上升，提示该猪有严重的肝损伤。除此以外，在NTBC撤药后也检测到肾小管损伤。2017年，该课题组通过降低NTBC维持给药剂量后发现，Fah-/-猪表现出生长迟缓和生化异常，如转氨酶升高，琥珀酰丙酮(SA)和甲胎蛋白(AFP)升高，并呈现出NTBC剂量依赖特征。随后，FAH-/-猪出现了肝纤维化、肝硬化和门静脉高压等慢性肝病表型[48]。该模型证实了Fah-/-猪作为一种新型肝硬化大动物模型，可以应用于包括药物开发和毒性测试以及评估现代成像等技术的研究。

6 总结与展望

最初，I型遗传性酪氨酸血症动物模型作为研究人类HT1疾病的病理生理以及治疗效果的理想动物模型而开发。而目前，它们已经被广泛应用于肝生物学、肝干细胞以及肝癌基因治疗的研究，同时也可用于制备人源化肝以及作为人肝细胞扩增的生物反应器。除此以外，I型遗传性酪氨酸血症动物模型也可用于评估肝外源细胞移植，如骨髓或成人胰岛细胞移植的疗效。这将使它们成为研究I型遗传性酪氨酸血症致病机制以及评估最新发现的肝祖细胞和肝细胞样细胞临床前疗效理想的模型。