冠状动脉结扎模型大鼠制作的经验体会*

高金环 张 红，2 杨洪军 唐仕欢 卫军营△

（1.中国中医科学院中药研究所，北京 100700；2.陕西省中医药研究院，陕西 西安 710003）

冠心病（CHD）是全世界病死率较高的疾病之一。具有高发病率、致死率、发病快等特点，诱导受损的心肌细胞再生成为治疗心肌梗死的重要临床目标，而标准化的动物模型是心肌细胞再生医学研究的基础［1-3］。本病属中医学“胸痹心痛”“真心痛”范畴［4-5］。其主要证型包括痰瘀互结证、气阴两虚证、气虚血瘀证和气滞血瘀证。在基础研究方面，由于CHD的许多病理生理资料难以从临床研究中获得，其防治上的进展有赖于基础研究上的突破，因此利用实验动物模型寻找有效的药物以及心肌梗死发病机制被广泛应用［6-7］。而建立稳定可靠的模型是决定实验成败的关键环节。目前，常用CLM有开胸结扎冠状动脉左前降支和开胸挤出心脏结扎方法，其中，开胸结扎冠状动脉左前降支是公认的标准CLM。而开胸挤出心脏的方法损伤较大、要求速度快、操作难度较大、心脏在体外暴露时间过长则会影响生存率等因素导致难以推广。笔者长期从事动物心梗、脑心血管疾病模型研究，曾进行大量开胸式冠状动脉左前降支动脉结扎方法的动物模型制备，完成课题组重大新药专项、国家自然基金、青年基金等多项课题，手术成功率高达90%以上。本研究结合以往的参考文献及笔者优化的实验方法和累积经验，对CLM的制备过程进行总结和探讨，供心血管疾病研究者参考。

1 实验动物选择

啮齿类动物（鼠、兔等）、猪、狗、猴等均可用于CLM的制作，其中啮齿类动物大鼠具有廉价易于购买、种系内纯性好、同系大鼠间遗传差异小、与人类有相似的血管解剖特点、有极强的抗感染能力等特点，因此实验中最为常用，使用率超过90%［8］。实验动物的体质量的选择也是一个重要因素，目前国内大多数文献认为应控制在250～350 g，但根据笔者长期实验经验认为应控制在270～320 g为宜，原因有三：1）体质量低于270 g以下的大鼠对麻药耐受较差，且术后死亡率高；2）体质量大于320 g的大鼠，血管粗细程度差异明显，影响实验结果的一致性。3）此阶段体质量的大鼠耐受性较强，可减少造模后的死亡率。

2 手术器械选择

在动物模型制备中，选择合适的器械显得尤为重要。不合适的器械会影响模型成功率，导致生存率降低。笔者在制作模型过程中深有体会。1）直镊：圆润的镊子不容易损伤心肌，镊子太锋利会造成心肌损伤，因此笔者一般选择2把圆润的直镊，长15 cm，直径0.5 cm，镊子前端带平台，撕心包膜使用。2）眼睑器：眼睑器是临床眼科用器械，由于大鼠胸部较小使用眼睑器大小合适，眼睑器还可调节撑开的宽度，增加手术视野，有利于模型制作。3）带针缝合线：带针缝合线有角针和圆针，角针更锋利一些，圆针更圆润损伤较小，后者更适合结扎冠状动脉左前降支动脉，笔者实验常用6-0的带圆针缝合线。4）持针器：长12 cm，应选择重量轻而细，结扎冠状动脉左前降支时力度容易掌控。5）纱布：将纱布卷成直径1.5 cm，长10 cm，垫在大鼠心脏下方，心脏会上移，有利于操作。 6）气管插管：有研究［9］显示造模时气管插管和面罩通气两种不同的呼吸管理方式对于CLM的成模率和远期成活率没有影响。但面罩通气要求速度快、胸腔开放时间不宜过长、比较适用于熟练操作者等因素制约，大部分实验人员还是选择气管插管的方法进行造模。笔者采用临床使用16 G的留置针，把前端尖端剪去制备成大鼠的气管插管备用［10］。

3 麻醉药物的选择

CLM制作需要在全身麻醉的状态下进行，而全身麻醉对动物的血液循环、呼吸、体温、基础代谢等均有较大的影响，甚至抑制呼吸导致死亡。因此，选择合适的麻醉剂非常关键，目前国内常用的麻醉药物有乙醚、水合氯醛、乌拉坦和戊巴比妥类等。其中乙醚，实验人员难以控制其麻醉的时间和深度；水合氯醛对胃肠道和呼吸道有一定影响，造模后易造成腹胀及死亡，长期实验不适合使用。笔者采用0.9%氯化钠溶液配制1%的戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉，其麻醉量容易掌控、副作用较小、清醒速度快。但需要注意几点：1）戊巴比妥钠需要避光保存。2）配置过程中要求无菌操作。3）按体质量精确计算给药剂量。4）避免注射皮下或肠腔，造成死亡或麻醉不成功。5）若麻醉不完全，可追加0.2～0.3 mL/只即可。

4 术前禁食时间

目前国内大部分研究认为造模前禁食不禁水12 h，但笔者发现术后大鼠进食量少，体质量减轻，死亡率增加。笔者在术前2 h禁食防止食管残留食物，影响气管插管操作及导致大鼠窒息术前自由饮水。保证室内温度23～25℃，湿度55%。

5 手术操作

CLM需要开胸操作，待大鼠进入完全麻醉状态后，将大鼠固定在鼠板上，碘伏消毒，将腋下1.5～2 cm备皮，备用。1）准备气管插管：将大鼠置于1个三角形的斜面上，用皮筋挂住大鼠的门齿 ，将大鼠头部略向后仰 ，用台灯照射大鼠的颈部，一手用镊子将大鼠的舌头向外牵拉，另一手用带管芯的16 G静脉留置针（剪去尖端）轻轻向上挑舌根，这时即可看见不断开合的声门 ，慢慢将插管对准声门向前探去，但不要接触到声门周围组织 ，待声门开放的时候，匀速将管送入声门，并拔出管芯。用一根棉花丝在管口试验，以判断是否在气管中，如果不是，可将插管退出少许，不用管芯进行2次插管，如果3次都没有插管成功，就应放弃这只大鼠。由于麻醉后大鼠体温下降，插管成功后，需将大鼠身下放置电热毯，温度设置在36.5～37.0℃，用胶布将插管固定在大鼠上颌和头部之间，连接小动物呼吸机（呼吸频率80～90次/min，潮气量4～6 mL/100 g，吸呼预设比1∶1），同时观察胸廓起伏，呼吸支持建立成功的标志是胸廓的起伏要与呼吸机工作频率一致，且声音顺畅无阻塞感［11］。检查呼吸机连接正常后，给大鼠监测心电图，右上、右下、左上、左下插入针形电极连接心电图。2）模型制作：以心尖搏动最强的点为中心 ，作一横行切口，长度前后距胸骨和脊柱各1 cm，在切口下方，鼠的身体下垫一个自制的纱布卷，依次切开皮肤，深浅筋膜，钝性分离胸大肌和前锯肌，显露肋骨，于肋骨第4，5肋间打开胸腔，用眼睑器撑开幅度至能完全暴露心脏，撕开中心位置的心包膜，此时心脏即往上翘起，用镊子掀开左心耳，找到肺动脉圆锥，于左心耳下1～2 mm处的位置穿线结扎冠状动脉左前降支，结扎深度1.5 mm，宽度3～3.5 mm，结扎时掌握好打结力度，看到大面积心肌缺血室壁跳动明显减弱，力度过大则会将心肌扎断［12］。结扎即刻心肌明显缺血，观察心电图显示ST段太高约0.2 mV，提示模型成功。3）术后缝合：观察大鼠5min，如果出现心律失常，可以在心脏表面滴少量的利多卡因或直接心脏按摩，多数心律失常能够恢复。用小棉球吸出胸腔的积血，用3号线在切开肋间的中间先缝一针，再依次缝合两端，缝合剩一针时将注射器前端连接软管插入胸腔将空气抽出形成负压，恢复肺的张力［13］。观察无异常后，缝合皮肤。4）气管插管有报道［1］称用硬膜外麻醉导管沿气管插管送入，用注射器轻轻回吸，以清除呼吸道分泌物。如此时大鼠呼吸平稳，即可拔出气管插管。但笔者实验过程中发现，大鼠处于麻醉状态拔出气管插管移除呼吸机，有些大鼠不耐受则会在清醒前死亡。笔者建议待大鼠清醒后移除呼吸机，拔出气管插管，将大鼠舌头拉出，用棉签清理大鼠痰液，保持呼吸道畅通，术后肌注青霉素，预防感染。大鼠清醒后可自由活动时放回鼠笼。

6 术后护理

CLM是一种死亡率较高的疾病，加之术后可能出现心律异常，因此术后护理非常重要［14-15］，应注意以下几点：1）避免大的噪音，如大声说话，物品突然倒地造成的声音等都有可能造成大鼠惊吓死亡。笔者在实验过程中曾发生东西坠落倒地导致心梗模型后的大鼠受到惊吓造成死亡。因此笔者建议在术后大鼠做处理时务必轻拿轻放，避免惊吓。2）术后大鼠在运输过程中一定注意轻拿轻放，避免大幅度晃动，以免造成死亡。3）饲养环境，保持温度23～25℃之间，湿度55%，保持通风，术后需要更换新的饲养笼垫料避免感染，在术后饲养过程中定期更换，始终保持干燥。因大鼠在术后2～4 d精神状态不佳，自由进食进水困难，故可将饲料放置在鼠笼内。术后严密观察记录大鼠精神状态，以便及时处理。

7 结 语

综上所述，CLM是心肌缺血疾病的研究基础，该模型操作可控、价格低廉、可重复性强，是心血管疾病研究者的首选。随着心血管疾病研究的不断深入，其模型制备方法随之不断的改进和优化。由于此模型对于大鼠机体损伤较大，一个环节的疏忽将可能造成大鼠死亡，模型制备的每一步都需要认真细致，笔者在操作过程中，严格控制麻醉药剂量、手术规范操作、术后及时护理等，模型成功率达到90%。本文对笔者制备CML模型的过程和经验进行总结，以供心血管疾病研究者参考。