双光子活体成像技术及其在免疫学中的应用①

张 记 吴玉章

(陆军军医大学全军免疫学研究所，重庆 400038)

机体免疫系统具有防御、监视及自稳功能,其功能异常会导致传染性疾病、自身免疫性疾病及恶性肿瘤等重大疾病的发生。机体的免疫应答是通过一系列免疫细胞与免疫分子间的相互作用实现的。几乎所有免疫细胞都是可移动的；信息在细胞的接触中快速地传递,免疫细胞在不同组织器官之间迁移[1]。 免疫应答相关分子的表达、空间转位及相互作用等功能信息也是瞬息万变的,在不同微环境中的功能具有时效性与差异性。因此，免疫细胞的运动、迁移及相互接触等动态信息的获取，对免疫应答与免疫治疗过程的直观呈现及机理的系统性解析非常重要[2]。

显微成像与流式细胞术等技术使免疫学家已获得了大量免疫分子的结构与功能信息，鉴定了很多重要的免疫细胞类型及其功能，极大地推动了免疫学的研究进程。但这些基于体外实验获得的数据，不能真实反映生物活体的精细结构、生理及病理环境。由体外研究获得的功能信息,需要在活体内验证。其次，基于静态节点的研究方法只适合对免疫系统一个状态的判断,无法确定各状态环节之间的衔接与发展。

1 双光子活体成像实验技术

分子成像技术及方法的发展,尤其是双光子扫描显微镜的出现与改进，为活体状态下免疫反应的动态过程研究提供了可能。双光子扫描显微镜技术具备以下4方面能力[3]：①高时空分辨率的三维成像；②多分子与细胞事件的并行检测；③长时程动态监测；④从亚微米到厘米的跨层次多尺度的系统性观察。基于上述技术，免疫应答过程中多种类免疫细胞的迁移、募集与相互接触的可视化成为可能。

1.1双光子成像的原理及特点 1931年双光子理论首先提出[4]：荧光分子在足够短的时间内遇上2个或多个光子，荧光分子就能同时吸收2个或多个光子。其物理学原理是：在单光子激发过程中，基态荧光分子在激光照射下吸收一个高能光子使分子从基态跃迁到激发态，随后到达亚稳态，最后从亚稳态返回基态并发射出较长波长的荧光光子。单光子荧光激发过程只吸收一个光子，是一个线性吸收过程。在多光子激发过程中，荧光分子同时吸收多个光子实现基态到激发态的跃迁，从亚稳态返回基态并发射出一个波长大于激发光波长1/n(双光子n=2)的光子。双光子荧光激发需要同时吸收2个光子，其跃迁概率跟激光功率成平方关系，所以双光子吸收是一个非线性过程，只有在高光子密度情况下才会发生显著的双光子吸收过程。

基于以上原理，传统的单光子激光共聚焦显微镜的局限性是：①单光子激发过程是线性激发，焦平面附近会产生荧光，导致成像时有较高的背景荧光，从而影响成像质量。②单光子激发过程一般是用高光子能量的可见光波段激发，荧光染料会产生毒素，导致光漂白与光毒性，损伤活体细胞，限制了其在活体组织中的使用。③为获得高分辨率的成像，必须保证共聚焦的针孔足够小；但孔径减小会阻挡掉大部分荧光。

而双光子荧光激发是一个非线性过程，通常双光子激光显微镜选择近红外光作为激发光，其特点如下[5]：①光损伤小。使用红外波长(长波长)的脉冲飞秒激光作为光源激发，能显著降低光损伤与光毒性；故双光子显微镜对活体细胞及组织的光损伤很小，适合于长时程的观察研究。②组织内源性吸收少。生物组织对近红外波段的内源性吸收较少，是探测活体组织成像的理想光学窗口。③穿透能力强。近红外光作为激发光，比单光子激发波长要长；在生物组织中，长波长的光比短波长的光受散射影响要小，从而容易穿透样品；因而双光子激光显微镜能达到更大的成像深度(200～1 000 μm)，可以对生物样品进行深层的研究。④分辨率高。双光子吸收截面很小，只在焦平面很小的区域内激发出荧光，局限于焦点处的体积很小的范围内。⑤光漂白小。漂白区域很小，焦点以外不发生漂白现象。⑥荧光收集效率高。与单光子共聚焦成像相比，双光子成像不需要针孔，提高了荧光收集效率，直接导致图像对比度提高。⑦适合多标记测量。许多染料荧光探针的多光子激发光谱比单光子激发谱要宽，因此就可以利用单一波长的激发光同时激发多种染料，从而得到同一生命现象中的不同信息，便于相互对照补充。

1.2动物活体成像的实验体系 实验动物长时程的活体成像，除硬件设备双光子显微镜外，其他必要的技术条件是：①荧光标记技术；②待观察组织的暴露及固定技术。待观察组织首先必须直接暴露在显微镜镜头下，这需要相应的外科手术。其次，细胞运动的长时程成像，要求观察视野必须是高度静止的，不能受到动物心跳与呼吸的影响。基于以上要求，活体成像的基本实验设计原则是[6]：根据待观察组织的解剖学位置、组织内观察深度、待观察细胞种类、待观察细胞运动速度、分辨率需求等因素选择合适的激光显微镜、荧光搭配方案及合理的暴露手术。

1.2.1活体成像实验的荧光标记 光学分子探针主要包括化学小分子探针、纳米颗粒及遗传编码型分子探针等[6]。常用的分子探针是化学探针与遗传编码的荧光蛋白。化学小分子探针由于其体积小且对生物分子功能的干扰小,在生命科学研究中发挥着重要作用。相对而言,基于荧光蛋白的遗传编码型分子探针,由于其准确的亚细胞定位能力、良好的生物相容性及光学信号不会随细胞分裂而减少等特点,使活体内数天至数月长时程、动态监测蛋白质分子事件成为可能。不同荧光的搭配使用，是实现活体内多分子事件同步光学观察的基础。长期示踪活细胞的荧光一般是CFSE(绿色)与 CMTMR(橙色)[4]。其他常用的遗传编码的蛋白标签有蓝色荧光蛋白(BFP)、青色荧光蛋白(ECFP)、绿色荧光蛋白(EGFP)、黄色荧光蛋白(EYFP)及红色荧光蛋白(DsRed)等[7]。

1.2.2活体成像实验组织暴露的外科手术 皮肤等组织的观察，不需要或只需要很小的暴露手术即可实现。但对淋巴结、脑组织、乳腺组织、真皮组织，尤其是腹腔内的组织(如肝脏、肠组织、胰腺组织等)则需要进行较大的外科暴露手术，并需要利用金属环、金属支架等进行固定，这个过程称为开窗[8]。在进行开窗的外科手术中，不能有感染及炎症出现，否则手术感染导致的炎症细胞浸润会影响实验结果。开窗是非常具有挑战性的外科手术，整个实验过程对动物饲养环境、显微成像实验室环境均有很高要求。当实验需要长达数天、数周观察的时候，上述操作的要求则更为严苛[9]。针对上述组织，不同实验室设计了多种开窗方案并取得了一定成功[10]。但手术中动物死亡、流血、窗口脱落、感染及组织轻微抖动等问题的出现，使成像实验的失败率很高。另一方面，动物在显微镜下观察需要定制合适的载物台，保证动物在观察时间内始终处于麻醉状态。为了保证活体成像观察数据的准确性及长时程观察的动物生理机能处于正常水平，还需要保证载物台的温度等其他细节。

2 双光子活体成像技术在免疫学中的应用

免疫应答的基本过程是:抗原呈递细胞在外周捕获抗原后运动到淋巴结，在淋巴结与T、B淋巴细胞接触；活化的淋巴细胞进入循环系统并到达效应器官发挥其免疫效应。2002年3篇发表在Science 的研究将双光子活体成像技术引入了免疫学领域。加州大学埃文斯分校的Cahalan团队研究了活体内淋巴结中T细胞与DC 细胞的相互作用过程[11]；NIH的Germain团队成像了活体中淋巴结内的T、B淋巴细胞的运动性及其抗原应答过程[12]；加州大学伯克利分校的Robey团队则在活体内可视化了淋巴细胞发育过程中胸腺细胞与间质细胞的相互作用[13]。在过去的16年中，活体成像技术应用到了免疫学的诸多领域:从淋巴细胞的发育到免疫细胞的活化，从免疫细胞间的相互作用到效应免疫细胞对靶细胞的杀伤。观察对象从各级淋巴器官(骨髓、淋巴结、脾脏、胸腺等)到免疫细胞发挥效应的各个器官(皮肤、肝脏、脑、肺等)；从机体的稳态维持，到感染性疾病、自身免疫性疾病，从肿瘤免疫微环境的组成到免疫相关药物的效应机制。多种器官的开窗手术方法得到建立，多种免疫细胞的运动细节及功能相关性得到揭示。免疫应答过程中多个新的关键性发现，加深或修正了我们对免疫学的理解。现从技术运用的角度，以具体的研究实例为依据，概括总结本技术在解决免疫学相关科学问题中的应用。

2.1可视化免疫细胞的运动规律，揭示其运动相关功能 CD4辅助性T细胞在控制胞内寄生虫感染中起着核心作用，但病原体特异性CD4 T细胞有效检测到感染细胞的过程尚不清楚。Filipe-Santos等[14]利用Lys-EGFP工具鼠及表达DsRed荧光的利什曼原虫感染模型，通过运用活体成像技术，描绘了感染部位CD4 T细胞的抗原识别动态图谱。研究者发现，活化的CD4 T细胞进入发炎组织与抗原特异性无关，病原体特异性T细胞倾向于在真皮感染位置减速并聚集；CD4 T细胞的抗原识别是异质性的，其与吞噬细胞既有稳定接触也有动态接触；并非所有感染细胞都会引起病原体特异性CD4 T细胞的阻滞或减速；感染细胞的密集成簇造成移动的CD4 T细胞很难接近。

Th17细胞与自身免疫性神经炎症的神经损伤相关，Siffrin等[15]利用双光子活体成像追踪了疾病特异性Th17在其动物模型EAE发病过程中的运动规律。他们发现疾病特异性Th17细胞与神经元细胞在病变位点存在持续的直接相互作用，并诱导发生严重神经损伤的早期信号。此发现突出了Th17细胞效应功能在神经元功能失常中的中心作用。

效应CD8 T细胞(CD8 TE)在嗜肝病毒感染中发挥关键作用。在小鼠HBV感染的模型中，Guidotti等[16]利用双光子成像技术追踪了CD8 TE细胞归巢到肝脏、识别抗原及展开其效应功能的过程。他们发现，循环CD8 TE“停泊”在血小板滞留的肝窦中；在滞留的早期，CD8 TE主动沿着肝血窦爬行，穿过内皮窗孔并延长胞质突起而探测血窦下方肝细胞存在的抗原；而肝细胞的抗原识别则通过渗出非依赖的方式引起CD8 TE的效应功能。

Liew等[17]利用活体成像技术，在肝脏无菌损伤模型中追踪iNKT细胞从损伤发生到损伤恢复整个过程的运动规律。其发现，iNKT在自身抗原驱动下，相当于损伤感知的检测器与调节器：iNKT对无菌损伤的反应分为排斥、滞留及浸润3个明显的阶段。“巡逻”的iNKT细胞最初排斥在肝损伤位点，随后被损伤位点通过自身抗原与细胞因子捕获，最后环绕在损伤位点。自身抗原对iNKT的活化产生IL-4，而非IFN-γ，促进肝细胞增殖，改善损伤愈合。与此类似，Wang等[18]则利用活体成像技术追踪肝损伤与修复过程中的中性粒细胞的时空运动轨迹、可视化中性粒细胞的功能与命运。他们发现，中性粒细胞在无菌肝损伤模型中会穿透损伤位点，在“拆除”损伤血管及新血管再生中扮演关键角色。在完成上述任务后，其不是在损伤位点死亡或被吞噬；相反，许多中性粒细胞再次进入脉管，执行预先“安排”的运动过程：在肺内逗留一段时间后上调CXCR4，最后进入骨髓并在骨髓内凋亡。

在肿瘤免疫中，浸润在实体瘤中的CTL与NK细胞是最重要的杀伤细胞，但两者浸润、清除肿瘤细胞的动力学过程未知。Boissonnas等[19]利用活细胞成像技术对CTL的运动规律进行追踪，发现肿瘤细胞的抗原表达决定CTL在肿瘤内的运行规律及深层浸润。活化的CTL 以极快的速度迁移，在距离表达同源抗原的肿瘤细胞很近的位置停止运动，而在肿瘤细胞死亡的区域CTL重新迁移。沿着血管迁移的CTL倾向于采用一种细长形态。当肿瘤细胞表达同源抗原时，CTL也会迁移到肿瘤深处；在无同源抗原的区域，CTL的浸润限制在肿瘤表面区域，并且既不停止运动也不杀伤细胞。Breart等[20]进一步在CTL过继转移导致肿瘤消退的模型中发现，过继转移的CTL导致肿瘤消退主要是通过CTL对单个肿瘤细胞直接作用，仅有极小的旁观效应。令人吃惊的是，单个CTL杀伤一个靶细胞需要很长时间，平均需要6 h。Deguine等[21]则利用本技术发现NK 细胞与CTL在肿瘤消退阶段具有完全不同的与靶细胞接触的动力学特征。他们发现，NKG2D配体驱动NK细胞在浸润肿瘤的活化与运动特征。在肿瘤收缩过程中，NK 细胞具有与其靶标动态接触的过程；与NK细胞相反，CTL 与表达其抗原的肿瘤细胞则形成稳定的接触。

2.2可视化免疫细胞之间的相互作用，揭示其时空关系 活体成像技术的主要优势是能观察分子与细胞在空间上的关系及时间上的联系，得到完整的动态过程。在免疫应答启动过程中，二级淋巴器官中存在着多种免疫细胞之间的相互作用，多是通过细胞间的相互接触实现的；其接触特征、接触时间的长短、运动的速度等参数与整个免疫应答的质量及结局密切相关。其他技术只能观察到各时间点上的横断面，且非是严格的同一位置。各时间点之间的关系、各位置之间的联系，是通过逻辑推理完成的，其中难免没有谬误。因此，活体成像是研究免疫细胞间相互作用的利器，是其他技术无法替代的。

在病毒感染的免疫应答启动过程中，树突状细胞(DC)亚群、辅助性CD4 T与效应性CD8 T细胞在淋巴结内发生着复杂的、动态的相互接触及相互作用，最终实现CD8 T细胞的克隆扩增、分化及记忆反应。双光子活体成像技术在揭示此类涉及时空转换过程的免疫应答机理中具有天然的优势。Eickhoff等[22]利用活体成像显微镜的淋巴结大视野成像发现，淋巴结内的CD4 T与CD8 T的初始启动在空间上是分开的；并且依赖于不同的DC亚群及不同的抗原呈递模式。在另一项研究中，Hor等[23]则发现了CD4 T与CD8 T的活化在时间上的不同步性。在免疫应答早期，CD4 T 与迁移来的皮肤DC成簇而发生相互接触，而CD8 T则不与迁移来的DC相互接触，其活化是延迟的；而在免疫应答后期，CD8 T与淋巴结定植的XCR1+DC成簇，并进而与已致敏的CD4 T发生相互接触，完成CD4 T对CD8 T活化的辅助。两项研究同时发现，XCR1+DC亚群是实现CD4 T 辅助CD8 T 应答的关键平台。类似的，B细胞与Tfh细胞在淋巴结生发中心的相互作用决定了体液免疫的质量。清华大学祁海团队[24]利用双光子活体成像技术揭示了影响两者相互作用的分子Ephrin-B1介导的机制。他们发现，生发中心B细胞高表达Ephrin-B1分子；Ephrin-B1以接触依赖的方式通过Tfh细胞上表达的EphB6受体排斥Tfh细胞，抑制抗原特异的Tfh-B细胞黏附互作，进而限制Tfh细胞在生发中心的停留时间。于是，在无Ephrin-B1的生发中心里，尽管有过量Tfh细胞，也无法产生足够的浆细胞。

本技术还能够揭示效应器官中免疫细胞运动之间的联系。趋化因子在病毒感染过程中招募活化的效应T细胞进入感染部位，但其招募T细胞的机制未知。Lim等[25]发现，气管中性粒细胞的运动轨迹“指导”了流感特异性CD8 T细胞的运动。他们借助于双光子成像技术，观察了流感病毒感染气管的中性粒细胞及CD8 T细胞运动的动态轨迹，发现中性粒细胞迁移留下持久的、富含CXCL12的痕迹，CD8 T 细胞沿着此轨迹到达感染部位。Bartholo-maus等[26]则利用此技术成像了中枢神经系统病变中效应CD8 T细胞与大脑结构之间的相互作用过程。中枢神经系统组织通常既不允许细胞通过，也不允许血液中大多数分子通过，其特化的血管能有效屏蔽血液循环。研究者在EAE大鼠模型中，成像了从CD8 T到达到脑组织到出现疾病症状，整个过程中CD8 T细胞与大脑结构之间的相互作用：CD8 T细胞到达软脑膜血管后停止运动并开始监视腔面，且其偏好于逆血流方向爬行，对外腔血管表面及其下方软脑膜进行持续扫描；在此处CD8 T细胞遇到呈递外源性抗原与髓鞘抗原的吞噬细胞；此接触刺激效应T细胞产生炎症因子，为其组织侵袭及炎症浸润提供触发信号。

2.3探究免疫应答分子细胞机制的有力工具 现代科学的证明逻辑非常强调“眼见为实”。活体双光子成像技术所获取的实验数据属于直接证据，其逻辑强度强于其他间接证据。双光子成像技术结合基因敲除小鼠等手段，在阐述基础免疫现象的细胞机理方面、在解析免疫相关疾病的分子机制方面及在探究免疫相关药物的工作机理方面，均有着重要的应用。

2.3.1解析基础免疫现象 睾丸、毛囊及胎盘均是免疫抑制微环境，多种机制共同阻止免疫攻击，保证了此处异体移植物的长期存活。与上述器官不同，骨髓内的微环境是存在免疫反应的，但此处异源性移植的存活效率依然等同于同源移植，此处免疫豁免的机理不得而知。Fujisaki等[27]利用高分辨活体成像技术揭开了其机理。他们发现活体中造血干细胞与Treg 细胞存在明显的共定位：二者聚集在颅盖骨及小梁骨骨髓的骨内膜表面，形成一种局部区域，此区域成为应付免疫攻击的“避难所”。

Sap基因敲除小鼠及其对应的人类疾病均具有明显的生发中心形成缺陷现象，但机制未知。祁海等[28]利用双光子活体成像技术发现：Sap缺陷不破坏CD4 T与抗原递呈细胞DC的稳定接触能力，但破坏CD4 T 与其同源B细胞的稳定接触能力，导致抗原特异性B细胞不能接收到适当水平的T细胞辅助；而Sap缺陷T细胞由于缺乏与B细胞稳定的相互作用，造成其不能有效招募并保留在新生的生发中心，进而不能维持生发中心反应。这为Sap缺乏导致生发中心缺陷提供了合理的分子解释。

在黏膜免疫领域，双光子成像技术也有重要应用。肠道固有层DC(LP-DC)分为两个亚群，一群是倾向诱导耐受，另一群偏好诱导炎症，但两者捕获肠道抗原的机制知之甚少。Mcdole等[29]用一种破坏性极小的肠道组织活体成像方法，可视化了肠道杯状细胞传送抗原的过程。他们发现：小肠杯状细胞在稳态下，可作为从肠腔传送低分子量、可溶性抗原到其底面的LP-DC的通道，并偏好于把抗原递送给耐受DC,而非炎症DC。此发现突出了杯状细胞在肠道免疫自稳中的重要功能。

2.3.2阐述免疫病理的分子细胞机制 全身感染或炎症会导致学习及认知功能受损，其机制知之甚少。Garre等[30]用双链RNA类似物poly(I∶C) 模拟病毒感染的免疫激活，用双光子显微镜长时程对小鼠主要运动皮质第V层锥体神经元突触后树突棘成像。他们发现，外周免疫激活导致树突棘丢失，损害学习依赖性树突棘的形成。并进一步发现，上述观察到的皮层突触的改变是由外周单核细胞通过TNF-α依赖机制破坏运动及学习相关树突棘的可塑性产生，而非通过中枢神经系统小胶质细胞产生。免疫复合物沉积导致的组织损伤是诸多自身免疫病发病的基础。中性粒细胞是最早招募到复合物沉积位点的细胞，在塑造组织免疫应答中扮演关键作用，但其与发病过程的关系并不清楚。Miyabe等[31]利用多光子活体成像技术及多种基因敲除小鼠，对免疫复合物诱导的小鼠关节炎成像，揭开了整个复杂过程的细节及相关机理：补体 C5a直接致使中性粒细胞黏附在关节内膜并启动炎症，且其受体C5aR是中性粒细胞黏附的关键分子；此黏附进而导致关节内皮β2 整合素依赖的中性粒细胞捕获，并造成中性粒细胞爬行方向的改变。进一步，BLT1介导第一批中性粒细胞渗出血管，随后CCR1促进中性粒细胞在关节内皮爬行，而CXCR2则放大晚期中性粒细胞的招募及其在关节内的存活。

2.3.3探究免疫相关药物的效应机理 CD20单抗能有效治疗B细胞肿瘤，但其导致B细胞清除的细节并不清楚。Montalvao等[32]利用活体成像技术发现肝脏是B细胞清除的主要位置，枯否细胞(KC)介导肝脏血窦内循环B细胞的瞬时捕获及吞噬。此发现解释了B细胞数量在二级淋巴结下降的原因。

PD-1抗体(aPD-1)在多种实体瘤中的有效性已得到证实。但aPD-1总体应答率低，如何提高aPD-1效果与应答范围极其重要。对aPD-1效应机制的解析有利于进一步提高药物效果。Arlauckas等[33]利用活体成像技术，亚细胞分辨率揭示aPD-1的实时命运与活性状态。其发现aPD-1在注射后的早期，能有效结合PD-1阳性肿瘤浸润CD8 T，但此结合非常短暂，几分钟后aPD-1被PD-1阳性肿瘤相关巨噬细胞捕获。他们进一步展示，巨噬细胞捕获aPD-1 依赖于药物Fc结构域多糖及宿主髓样细胞Fcγ受体。在注射aPD-1之前阻断Fcγ受体，可以很大程度延长aPD-1与肿瘤浸润CD8 T的结合时间，进而增强aPD-1的治疗效果。

2.4发现新现象，修订旧观点 活体成像技术的长时程、大视野观察可以发现诸多细胞层次上有趣现象。活体成像技术发现了中性粒细胞成群“蜂拥”密集招募于感染位点的现象[34]。中性粒细胞从血液招募到损伤位点是早期固有免疫应答的特征之一。中性粒细胞渗出血管后，展现出极度协调的趋化性，并出现“成簇”现象，其特征类似于昆虫的密集“蜂拥”行为。Lammermann等[35]利用双光子显微镜技术揭示了上述局部死亡细胞信号长距离传播的分子机制；并发现中心粒细胞密集成群行为协同胶原纤维等形成一个有边缘的、紧密的伤口“密封”，此“密封”实现了把感染部位从周围正常组织区分出来的效果。

祁海团队在淋巴结生发中心发现了T-B 细胞“纠缠”现象[36]。利用双光子显微活体成像技术，他们发现生发中心里T-B细胞互作与其他组织部位不同，每次互作时间很短，但胞膜接触面积很大，使T细胞可以通过这种接触面迅速向B细胞胞吐传递预先已经准备好的促增殖、促存活的辅助信号。通过这种“纠缠”般短暂而频繁的接触，T细胞可以更容易鉴别哪些B细胞是高亲和力的，使这些B细胞积攒更多辅助信号。他们还发现，B细胞表达ICOSL配体，通过刺激T细胞的ICOS受体促进T细胞钙响应，进而增大纠缠互作中T-B细胞的接触面积及T细胞通过胞吐传递辅助信号的效率。

Woodruff等[37]则在流感疫苗接种中发现了淋巴结定植DC(LN-DC)的跨节点迁移现象。在疫苗接种中，LN-DC的合适刺激与接种免疫的有效性密切相关。利用小鼠的灭活流感疫苗模型结合全淋巴结成像方法，其观察到LN-DC在疫苗接种几分钟内产生跨淋巴结节点的复位，进入到特异抗原收集位点。LN-DC在到达特异抗原收集位点后获取病毒抗原，启动病毒特异性CD4 T 细胞活化；并可以在缺少皮肤DC的情况下，导致生发中心形成及产生B细胞记忆。此揭示了LN-DC在快速定位病毒抗原、驱动T细胞群体早期活化中的重要地位。

华中科技大学张智红团队则利用长时程活体成像发现了实体瘤微环境中的“免疫抑制环”现象[38]。该团队利用多色荧光活体成像技术观察了黑色素瘤联合免疫治疗中的关键细胞事件。他们发现，Treg 细胞在实体肿瘤周围形成一个免疫抑制环；联合免疫治疗能减轻免疫抑制、引起浸润的内源性免疫细胞瞬间活化、促进CTL聚集并加速DC浸润。

Gabanyi等[39]发现了肠道内肌肉层巨噬细胞的快速活化现象。小肠组织中存在着多种类型巨噬细胞，固有层巨噬细胞是靠近小肠壁的一群细胞，而肌层巨噬细胞则位于小肠组织的深层部位。利用多光子活体显微镜及多种荧光报告小鼠，他们观察到两群巨噬细胞不仅形态与细胞运动方面存在差异，其周围小肠神经元分布也存在差异。肌层巨噬细胞与活化的神经元密切相关，其表面受体对神经元产生的去甲肾上腺素信号产生应答。利用本技术可以动态观察的特点，他们还发现肌层巨噬细胞能在感染后1～2 h内激活，明显快于完全依赖免疫系统的应答过程。

活体成像技术修订了CTL杀伤靶细胞的部分认知。体外实验数据表明T 细胞能快速有效的杀伤靶细胞，但Halle等[40]则发现活体内CTL对病毒感染细胞的杀伤效率并非如此高。他们在小鼠病毒感染模型中利用双光子活体成像，通过实时成像及数学模型分析定量了CTL介导的杀伤效率：平均1个CTL 1 d时间杀伤1～16个病毒感染细胞；而病毒诱导MHCⅠ分子下调后，CTL则不能破坏其靶细胞。他们还发现CTL在杀伤过程中不与靶细胞形成稳定突触，且每个CTL 在功能上具有强烈的异质性。

3 小结与展望

虽然双光子荧光显微成像技术有着诸多优点，但过高的平台要求及技术要求，使其没有像共聚焦显微镜那样得到非常普遍的应用，可谓是一个贵族技术。首先，其需要昂贵的显微镜配置平台，通常需要1～2台双光子显微镜及1台共聚焦显微镜相配合。其次，需要根据待成像免疫器官及疾病器官的不同，设计、定制个性化的载物台及固定装置。第三，需要多种荧光报告工具小鼠。第四，需要长时间的工具鼠与基因敲除小鼠的杂交。第五，需要强调的是，双光子活体成像技术作为一种影像学技术，其仍需与其他技术联合才能完整地完成科学问题的证明。

在免疫学领域，到目前为止全球仅有十余家实验室可以稳定使用本技术高效产出。但随着技术的逐步积累，双光子活体成像技术会得到进一步的普及。双光子活体成像技术动态可视化的特点，必将使其在现代生命科学的诸多领域具有更为广泛而深入的应用。

致谢：感谢华中科技大学张智红教授及其团队的技术培训。