序列相似性家族3A在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞氧化损伤中的作用

廖鹏志，刘 端，郑月宏

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院血管外科，北京 100730

2型糖尿病是一种可以损伤多个靶器官、引起多种并发症的慢性疾病，在中国成年人中发病率为11.6%[1]。糖尿病相关血管并发症是糖尿病患者的主要死因，其中包括糖尿病足、糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变。糖尿病引起的血管损伤与高糖有关，高糖继发的糖代谢紊乱以及晚期糖基化终末产物(advanced glycationend products, AGE)引起活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)过表达进而激活了促炎信号通路[2]。血管壁内的ROS增多在糖尿病血管病变中起重要作用，ROS的一个重要来源就是线粒体[3]，但高糖是如何通过线粒体产生ROS的，其具体机制还未完全阐释清楚。

序列相似性家族3(family with sequence similarity 3，Fam3)基因家族是1个新发现的细胞因子样基因家族，包含Fam3A、Fam3B、Fam3C和Fam3D 4个成员[4]。4个基因之间的相似性在31.6%～53.3%间。Fam3家族参与一系列病理生理过程，其中包括非酒精性脂肪性肝病、糖尿病和肿瘤[5- 6]。Fam3A包含230个氨基酸残基，可在人体多种组织中广泛表达，其中在血管内皮表达最多[4]。作为一种重要的糖脂代谢调节因子，Fam3A可作用于线粒体，促进ATP合成和分泌[5]。Fam3A的高表达可明显抑制高糖血症、脂肪肝，其机制可能与磷脂酰肌醇- 3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(protein kinase B，PKB,即AKT)信号通路相关[5]。最近研究发现，Fam3A可通过减少线粒体ROS合成、抑制细胞色素C释放和降低ATP合成的下降程度，进一步抑制细胞凋亡[7- 8]。尽管以往研究显示Fam3A可以抑制过氧化氢或者衣霉素引起的线粒体ROS生成增多，但其在高糖引起的血管损伤中是否也能发挥同样的作用目前尚不清楚。本研究检测了高糖刺激下人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的Fam3A表达水平，探讨了Fam3A在高糖引起的ROS产生及线粒体能量合成中的作用。

材料和方法

材料HUVECs(货号：#8000，批号：15536，有效日期：2020年12月1日)、内皮细胞培养基(endothelial cell medium，ECM)(货号：1001)购自美国ScienCell公司，高糖培养基用葡萄糖(货号：G8270)购自美国Sigma公司；siFam3A试剂盒(货号：stQ0012863- 1)购自广州市锐博生物科技有限公司，逆转录试剂盒(货号：ah301)购自北京全式金生物技术有限公司，MinuteTM动物细胞/组织总蛋白提取试剂盒(货号：SD- 001/SN- 002)购自美国Invent公司，ELISA试剂盒(货号：SEK356Hu)购自美国Cloud-Clone公司，OxiSelectTMIn Vitro ROS/RNS 试剂盒(货号：STA- 347-T)购自美国Cell Biolabs公司，ATP检测使用试剂盒(货号：S0026)购自北京碧云天生物技术有限公司；抗体P-p38(#4511)、p38(#8690)购自美国Cell Signaling Technology公司。

细胞培养参照ScienCell公司提供的标准流程进行复苏传代，具体为将HUVECs置于37℃、5%CO2的培养箱中，湿润条件下贴壁生长，培养液为5%FBS ECM。收集第6～8代细胞冻存于液氮中备用。

Fam3A表达的检测HUVECs用5%FBS-ECM培养至贴壁面积大于90%后，采用无血清ECM预处理24 h后分为对照组和高糖组两组：对照组更换为5.5 mmol/L葡萄糖的ECM继续培养48h待检；高糖组更换为33.3 mmol/L葡萄糖的ECM分别继续培养6、12、24、48 h后待检；每个样本设置3个复孔。

RT-qPCR：TRIZOL法提取细胞总RNA，逆转录为cDNA模板，依照SYBR PREMIX EX TAP TM说明书行PCR检测，引物序列：Fam3A sense链5’-ACCCTGGTGTTCGTGGCA- 3’，antisense链5’- AGCTCCTTGGCGTTCCTG- 3’。

ELISA：采用MinuteTM动物细胞/组织总蛋白提取试剂盒提取HUVECs总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，Fam3A ELISA试剂盒测Fam3A蛋白浓度。

小干扰RNA转染HUVECs生长至贴壁面积达到80%后，参照siFam3A试剂盒标准流程分别用siNT和siFam3A各转染两组，24 h后检测转染效率，48 h后采用无血清ECM处理24 h，然后分为siNT对照组、siNT高糖组、siFam3A对照组、siFam3A高糖组4组，两个对照组均更换为5.5 mmol/L葡萄糖的ECM继续培养24 h待检，两个高糖组均为更换为33.3 mmol/L葡萄糖的ECM继续培养24h后待检；每个样本设置3个复孔。

细胞内ROS测定:采用PBS溶液收集HUVECs(1～2)×107/ml，4℃超声匀浆，12 000 r/min离心5min取上清获得ROS检测样本，ROS试剂盒检测ROS。

细胞内ATP检测:HUVECs 4℃条件下裂解，12 000 r/min离心5min收集上清获得待测样本，ATP检测试剂盒进行检测，结果以占siNT对照组百分比表达。

线粒体氧耗率的检测：在37℃环境下采用XF24细胞内分析仪(Seahorse Bioscience，USA)检测线粒体氧耗率(oxygen consumption rate, OCR)，BCA法检测蛋白浓度，OCR结果用pMO2/(μg蛋白·min)表示。

P-p38和p38的检测：采用Western blot法，MinuteTM动物细胞/组织总蛋白提取试剂盒提取HUVECs总蛋白，BCA法测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳、ImageJ软件分析蛋白条带。所用抗体为P-p38、p38、β-actin。

统计学处理采用SPSS 16.0统计软件，实验数据以均数±标准误表示，组间均数比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

各组细胞内Fam3A表达水平培养6、12、24、48 h后，高糖组Fam3A mRNA与对照组的相对表达量分别为1.38±0.09、1.52±0.11、2.52±0.19、2.34±0.20，其中，24h组与对照组相比差异有统计学意义(t=13.296，P=0.000)；Fam3A蛋白浓度分别为(69.49±43.44)、(86.73±20.06)、(173.82±33.28)、(125.94±35.95)pg/ml，其中，24 h组明显高于对照组的(39.45±33.78)pg/ml (t=4.907，P=0.006)。

各组细胞内ROS含量检测结果siNT高糖组细胞内ROS含量为(8217±794)RFU，明显高于siNT对照组的(3982±398)RFU(t=15.109，P=0.002)；siFam3A高糖组细胞内ROS含量为(11 910±1 001)RFU，明显高于siFam3A对照组的(4171±402)RFU(t=9.705，P=0.010)和siNT高糖组(t=4.026，P=0.048)。

各组细胞内ATP水平检测结果以siNT对照组ATP合成量为基线，siNT高糖组、siFam3A对照组和siFam3A高糖组细胞内ATP合成相对值分别为(61.2±5.6)%、(94.6±8.4)%和(29.7±2.7)%，siNT高糖组明显低于siNT对照组(t=12.001，P=0.007)，siFam3A高糖组明显低于siFam3A对照组(t=20.742，P=0.002)和siNT高糖组(t=18.814，P=0.003)。

各组细胞内线粒体OCR的检测结果siNT高糖组的线粒体OCR为(0.57±0.05) pMO2/(μg蛋白·min)，明显低于siNT对照组的(1.12±0.09) pMO2/(μg蛋白·min)(t=6.804，P=0.021)；siFam3A高糖组的线粒体OCR为(0.31±0.03) pMO2/(μg蛋白·min)，明显低于siFam3A对照组的(1.01±0.09) pMO2/(μg蛋白·min)(t=19.876，P=0.003)和siNT高糖组(t=21.444，P=0.002)。

各组细胞P-p38的表达情况Western blot检测结果显示，以siNT对照组为基线，siNT 高糖组、siFam3A对照组和siFam3A高糖组的P-p38相对表达量分别为2.239±0.353、0.816±0.120和1.160±0.185，siNT高糖组明显高于siNT对照组(t=6.075，P=0.026)，siFam3A高糖组明显高于siFam3A对照组(t=6.242，P=0.024)，低于siNT高糖组(t=9.686，P=0.010)。

讨 论

Fam3A是一种重要的糖脂代谢调节因子。研究发现，在高脂饮食饲喂的糖尿病小鼠肝脏中，Fam3A表达明显减少[5]。在糖尿病小鼠模型中，肝脏过表达Fam3A可以明显减弱高糖血症、胰岛素抵抗和脂肪肝，其机制和激活PI3K/Akt信号通路抑制肝脏的糖异生和脂肪生成相关。Fam3A除了在肝脏中高表达之外，还在血管中膜高表达，提示Fam3A可能参与了血管疾病的发生。本研究分别采用普通和高糖ECM培养HUVECs，结果显示，培养24h后，高糖组Fam3A的mRNA和蛋白表达水平均明显高于对照组，提示高糖可以诱导HUVECs高表达Fam3A。

体外研究发现，Fam3A过表达可以促进血管平滑肌细胞的增殖与迁移；在大鼠颈动脉损伤模型中，Fam3A过表达可以加重颈动脉球囊损伤后的内膜增生[9]。在神经HT22细胞中，过氧化氢可以明显抑制Fam3A的表达；Fam3A表达上调可以减少过氧化氢引起的乳酸脱氢酶释放。过表达Fam3A可以减弱过氧化氢引起的ROS生成，并减弱ATP合成的下降程度，其作用机制和PI3K/Akt信号通路的激活相关[8]。最近研究发现，衣霉素可以在mRNA和蛋白层面减少Fam3A的表达。过表达Fam3A可以抑制衣霉素引起的HT22细胞凋亡和内质网应激，其机制可能是Fam3A通过C/EBP同源蛋白10-Wnt通路减少线粒体ROS生成、抑制细胞色素C释放和保护线粒体膜电位相关[7]。在小鼠实验中还发现，Fam3A可能是过氧化物酶体增殖物激活受体γ的一个下游靶基因[10]。血管壁内的ROS生成增多在糖尿病血管损伤的发病中起重要作用。在慢性高糖血症的刺激下，大量葡萄糖持续内流进入细胞质内，导致细胞内ROS生成增多[11]。糖尿病常引起代谢紊乱，如血糖和游离脂肪酸浓度升高，进而可以通过激活蛋白激酶C信号通路增加NADH氧化酶的活性促进ROS生成[12]。研究发现，1型糖尿病和2型糖尿病的血管内NADH氧化酶表达和活性均升高[13- 14]。脂质氧化引起的ROS生成增多会引起线粒体功能障碍进而诱发细胞凋亡[15- 16]。ROS可以通过以下4条相互关联的高糖血症驱动途径发挥作用：(1)多元醇途径；(2)晚期糖基化终产物；(3)蛋白激酶C途径；(4)己糖胺途径[3,11,17- 18]。氧化应激还可以促进DNA链断裂，激活多聚(ADP-核糖)聚合酶，进而活化核因子-κB信号通路，直接引起内皮功能障碍[19]。本研究结果发现，siFam3A高糖组细胞内ROS含量明显高于siNT高糖组，ATP合成相对值明显低于siNT高糖组，线粒体OCR明显低于siNT高糖组，提示敲低Fam3A基因表达可加重高糖引起的ATP合成减少及线粒体OCR降低，同时促进高糖时ROS生成增多，初步说明Fam3A可能是通过缓解线粒体功能障碍在高糖引起的ROS生成增多发挥保护作用。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者。MAPK的亚族中，p38 MAPK信号通路已被证实在多种肿瘤细胞、气管平滑肌细胞和心肌细胞等不同的细胞内参与调节ROS的生成[20- 23]。本研究结果显示，siFam3A高糖组的P-p38相对表达量明显低于siNT高糖组，说明p38 MAPK激活受到抑制，提示Fam3A可能是通过p38 MAPK信号通路调节高糖诱导的HUVECs内ROS生成。

综上，本研究结果发现，高糖可以诱导HUVECs高表达Fam3A，敲低Fam3A基因表达可加重高糖引起的ATP合成减少及线粒体OCR降低，同时促进高糖时ROS生成增多。Fam3A可能是通过p38 MAPK信号通路调节高糖诱导的HUVECs内ROS生成。更多的机制需要进一步的研究及验证。

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