ELISA方法在猪瘟抗原抗体检测上的应用

庄金秋，梅建国，张 颖，王 艳，李 峰

（1. 山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；2. 滨州贝尔凯瑞生物技术有限公司，山东滨州 256600）

ELISA方法在猪瘟抗原抗体检测上的应用

庄金秋1，2，梅建国1，2，张 颖1，王 艳1，李 峰1

（1. 山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；2. 滨州贝尔凯瑞生物技术有限公司，山东滨州 256600）

本文总结了猪瘟抗原检测，包括双抗体夹心ELISA、竞争ELISA、抗原捕获ELISA和NASBAELISA，以及猪瘟抗体检测方法，包括间接ELISA、竞争ELISA、液相阻断ELISA和斑点ELISA方面的研究进展。

猪瘟；ELISA；间接ELISA；抗体检测

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种严重危害养猪业的传染病。猪瘟抗体检测是免疫效果评价的主要手段。目前，世界动物卫生组织（OIE）推荐的猪瘟抗体检测方法是酶联免疫吸 附 试 验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和荧光抗体中和试验（Fluorescent antibody virus neutralization test，FVNT）。由于FVNT对试验条件和操作人员的要求很高，且耗时长，仅适用于专业实验室进行少量样本检测，不宜推广应用。因此ELISA方法是目前国际上认可的唯一适合大规模应用的血清学检测方法，既可用于测定猪瘟抗体，又可用于测定猪瘟抗原。本文综述了近年来ELISA方法在猪瘟抗原抗体检测应用方面的研究进展，以期为临床兽医工作者和广大养殖场户更好地诊断和防治猪瘟提供参考。

1 猪瘟抗原检测

1.1 双抗体夹心ELISA

双抗体夹心ELISA是检测CSFV抗原的常用方法。汤赛冬等[1]用提纯的高效价CSFV抗体及兔抗CSFV血清作为包被抗体和酶标记抗体，建立了双抗体夹心ELISA方法，用于检测CSFV抗原，经与进口单抗ELISA同步检测45份可疑样品，发现阳性结果符合率达97.7%。秦彤[2]利用兔抗猪瘟IgG、猪抗猪瘟IgG和羊抗兔酶标抗体，建立了双抗体夹心ELISA。曹兴萍等[3]用双抗夹心ELISA法检测规模化猪场临床无异常种猪抗凝全血，共检测22个猪场，检测样品361份，检出阳性率为2.2%。双抗体夹心ELISA法在种猪隐性感染、疑似疫情诊断、疫源净化，以及猪瘟病原、流行病学调查与防控等方面均有较强的实用性。

1.2 竞争ELISA

张富强等[4]应用c2410筛选噬菌体肽库获得与其特异性结合的噬菌体拟位的基础上，分析噬菌体拟位的免疫反应性，建立依赖c2410和噬菌体拟位的竞争性ELISA，用于诊断和检测临床组织样品中的CSFV抗原，并与国际标准的CSFV抗原捕获ELISA比较，发现所建立的竞争性ELISA比抗原捕获ELISA具有更高的敏感性，可作为CSFV抗原的常规检测方法在基层推广应用。

1.3 抗原捕获ELISA（AC-ELISA）

AC-ELISA是一种特异、敏感、快速、简便且实用的方法，是检测CSFV的有效方法。高华峰等[5]应用抗原捕获ELISA方法，分别对现行猪瘟疫苗毒、接种疫苗后产生定型热的兔脾和不同地区可疑猪瘟组织样品进行检测，发现AC-ELISA对猪瘟强毒组织样品的检测效果良好，但对弱毒并不敏感，因而可用于野毒感染鉴别。陆芹章等[6]制备了猪瘟单克隆抗体，用AC-ELISA检测CSFV，并用PCR方法作比较，发现30份猪瘟阴、阳性病料的AC-ELISA试验结果与PCR检测结果相符。刘建文等[7]将筛选的CSFV特异性单抗1E2、3B7和4B6纯化后等量混合后包被酶标板（捕捉抗体），与兔抗CSFV IgG（检测抗体）联合应用，建立了CSFV抗原捕获ELISA方法，发现与病毒分离和RT-PCR方法符合率分别为86.2%和90.3%。该方法将单抗的特异性和ELISA方法的敏感性有机结合起来，能够短时间内准确、快速、直接检测大批量样品中的CSFV抗原，明显优于病毒分离和免疫荧光等方法，更适合于各级兽医研究机构和生产单位应用。

1.4 依赖核酸序列的扩增技术（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）

NASBA是在PCR的基础上发展起来的1项扩增RNA的新技术，是由1对引物介导的、连续均一的体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。聂福平等[8]以CSFV E2基因为研究对象，将NASBA技术与液相杂交和ELISA相结合，建立了NASBA-ELISA检测方法，应用该法对采自重庆市部分地区猪场的125份样品进行了检测，发现CSFV阳性检出率为5.6%，与RT-PCR法的检出符合率为94.4%，检测灵敏度是RT-PCR的100倍。本方法的建立为CSFV的检测提供了一种快速特异的方法。

2 猪瘟抗体检测

2.1 间接ELISA

间接ELISA是目前检测CSFV抗体最常用的方法。由于灵敏性高、技术比较成熟、试剂盒已商品化、质量较稳定和操作快捷等优点，在我国基层和实验室得到全面推广。

2.1.1基于CSFV全病毒的猪瘟抗体间接ELISA 刘胜江[9]、于涟等[10]和陈春旺等[11]先后用纯化CSFV及猪瘟兔化弱毒乳兔组织冻干疫苗为原料，提取CSFV抗原，以酶标葡萄球菌蛋白A（PPA）代替酶标抗猪IgG，建立了间接PPA-ELISA法，其反应能被猪瘟纯化抗原或疫苗培养液所抑制。杜伟贤等[12]用猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞苗为材料提取CSFV抗原，以羊抗猪IgG-HRP结合物为免疫试剂，建立了间接ELISA法，也取得了预期效果。

2.1.2基于E2蛋白的猪瘟抗体间接ELISA 在CSFV结构蛋白中，囊膜蛋白E2是CSFV中免疫功能最重要的蛋白，携带有能刺激机体产生保护性免疫的抗原决定簇，可诱导动物机体产生保护性的中和抗体，是近年来研制新型疫苗和血清学诊断抗原以及研究CSFV抗原变异的主要对象。余兴龙等[13]、王海震等[14]、尹双辉等[15]、谢金文等[16]、李文良等[17]、苏佰通[18]、冯春花等[19]、刘丽娅等[20]和蔺辉星等[21]先后以大肠杆菌表达纯化后的重组E2蛋白作为包被抗原，建立了间接ELISA方法。李娇等[22]以纯化的CSFV重组E2蛋白为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白（HRP-SPA）为酶标二抗，研制了检测CSFV抗体的间接PPA-ELISA诊断试剂盒，发现其具有良好的重复性、敏感性和特异性。何艳[23]、孙元等[24]和徐璐等[25]先后将昆虫杆状病毒表达的重组E2蛋白纯化后作为ELISA包被抗原，建立了基于重组E2蛋白的间接ELISA方法。李文良等[26]以大肠杆菌表达纯化后的重组E2蛋白作为抗原，建立了检测IgM抗体的间接ELISA方法。基于E2蛋白的猪瘟抗体间接ELISA方法操作简便、快速、敏感性高且特异性强，为CSFV的快速诊断、疫苗免疫猪群抗体监测、疫苗效果评价和CSFV流行病学调查提供了快速、简便的血清学检测方法，适合基层兽医单位广泛推广应用。

2.1.3基于E0蛋白的猪瘟抗体间接ELISA 糖蛋白E0是CSFV包膜蛋白与核酸酶，也是病毒吸附进入敏感细胞的必需蛋白，其活性对病毒在宿主体内的持续感染有直接关系，是诱导机体产生中和抗体的保护性抗原之一。目前研究的CSFV基因工程疫苗主要以E2蛋白为抗原，基于CSFV E0蛋白建立相应的抗体检测技术对监测猪瘟的流行情况、区分E2标记疫苗免疫猪和野毒感染猪具有重要意义。陈振海等[27]、贾洪林等[28]、李鹏等[29]和吴素丽等[30]先后以大肠杆菌表达的CSFV重组E0蛋白经纯化后作为包被抗原，建立了检测猪瘟抗体的E0-ELISA方法。刘芳冰[31]利用毕赤酵母表达CSFV E0蛋白，建立了间接ELISA。E0-ELISA方法简便、特异、稳定，在标记疫苗的研制和应用上具有重要的血清学鉴别功能，对于监测CSFV的流行情况和疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要作用。

2.1.4基于NS3蛋白的猪瘟抗体间接ELISA NS3蛋白是CSFV的非结构蛋白，是病毒复制增殖必需蛋白，是病毒引起细胞病变作用的主要因子，在动物体内能产生不同程度的抗体。以NS3蛋白为抗原建立间接ELISA可以作为CSFV的血清学鉴别诊断方法。蒋大良等[32]和陆欣然等[33]先后以大肠杆菌表达的CSFV重组NS3蛋白纯化后作为包被抗原，建立了检测猪瘟NS3抗体的间接ELISA方法。该检测方法与IDEXX公司检测试剂盒具有较高的一致性。基于NS3蛋白的猪瘟抗体间接ELISA方法可以区分全病毒（包括疫苗毒和野毒）和重组腺病毒（rAd-E0-E2）感染的猪群，极大促进了CSFV的净化或根除，具有广阔的应用前景。

2.2 竞争ELISA

抗体测定一般不使用竞争法，但当抗原中杂质难以去除或抗原的结合特异性不稳定时，可采用该法测定抗体。梁冰冰[34]用重组杆状病毒表达的CSFV重组E2蛋白作为ELISA包被抗原，用辣根过氧化物酶标记的E2蛋白中和性单克隆抗体作为竞争抗体，建立了用于检测CSFV中和抗体的重组E2蛋白竞争抑制ELISA方法（Competitive inhibition ELISA，CI-ELISA），用于检测CSFV中和抗体。用该法和阻断ELISA试剂盒方法同时对采自部分省份的370份现地血清进行CI-ELISA检测，发现二者的符合率为96.7%。张新成等[35]选择3个场共12头母猪，在产前136～140 d进行猪瘟兔化弱毒（细胞苗）疫苗接种（4 mL/头），通过竞争ELISA检测其所产仔猪在7、14、21、28、35和42日龄时血清中抗体水平，监测了母源抗体在仔猪体内的消长规律，探索了仔猪猪瘟疫苗最佳首免日龄。

2.3 液相阻断ELISA

刘胜宇等[36]利用液相阻断ELISA法测E2蛋白产生的抗体。因其与中和抗体具有高度的正相关性，在一定区间内可以用阻断率高低来估测猪群保护性抗体水平。蒋卉等[37]通过比较14种国内外猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒的符合率，发现6种阻断ELISA试剂盒的符合率均可达到100.0%，在敏感性和特异性上整体优于另外8种间接ELISA试剂盒。

2.4 斑点ELISA（Dot-ELISA）

Dot-ELISA不仅保留了常规ELISA的优点，而且弥补了抗原或抗体对载体包被不牢等缺点，具有敏感性高、特异性强、被检样品用量少、节省材料、不需特殊仪器、结果判定简单易行和便于长期保存等特点。李勇等[38]、陈永锋等[39]和邓何生等[40]先后应用Dot-ELISA方法对猪瘟抗体水平进行了监测，发现Dot-ELISA适用于规模化猪场猪瘟抗体水平的监测。

3 讨论

我国现阶段猪瘟呈现出区域性、散发性流行，其临床症状不典型，容易产生温和型和非典型猪瘟共存、持续和隐性感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存，以及母猪繁殖障碍等，使该病防治成为一大难题，给我国养猪业带来严重危害。目前猪瘟ELISA抗体诊断试剂盒种类较多，在实际应用过程中均具有合理性。徐璐等[41]认为在我国猪瘟疫苗强制免疫的政策下，选择间接ELISA抗体试剂盒更适合我国实际情况。间接ELISA更侧重于敏感性，液相阻断ELISA使用了单克隆抗体，检测的特异性更高。在进行ELISA检测方法评价时，一定要寻找敏感性和特异性最佳的平衡点和结合点。相信随着分子生物学的发展及电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，ELISA方法将更为简便、实用和标准化，成为能够被广泛应用的抗体检测方法。

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Application of ELISA Methods in Detection of Antigen and Antibody of Classical Swine Fever

Zhuang Jinqiu1，2，Mei Jianguo1，2，Zhang Ying1，Wang Yan1，Li Feng1

（1. Binzhou Animal Husbandry and Veterinary Research Institute，Binzhou，Shandong 256600，China；2. Binzhou Baer Carrey Biotechnology Co.，Ltd.，Binzhou，Shandong 256600，China）

In this paper，the progress of Classical swine fever（CSF）antigen detection methods was summarized，including DAS-ELISA，competitive ELISA，AC-ELISA and NASBA-ELISA. Meanwhile，the progress of detection method of CSF antibody was also introduced，including indirect ELISA，competitive ELISA，liquid phase blocking ELISA and Dot-ELISA.

Classical swine fever；ELISA；indirect ELISA；antibody detection

山东省重点研发计划项目（2015GSF121027）；山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目（SDAIT-08-17）

S852.65

B

1005-944X（2018）01-0065-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2018.01.019

杜宪）