绿原酸在脑胶质瘤治疗中的应用前景*

杨靖怡 杨守博 康庄 康勋 综述 李文斌 审校

脑胶质瘤是中枢神经系统最为常见且预后较差的原发性恶性肿瘤，占美国脑肿瘤注册中心统计所有脑和中枢神经系统肿瘤的31%，占恶性脑肿瘤和中枢神经系统恶性肿瘤的81%，每年发病率为5/100 000例，且呈逐年递增趋势［1］。低级别胶质瘤（WHOⅠ、Ⅱ级）的中位生存时间为5～8年；高级别胶质瘤（WHOⅢ、Ⅳ级）称为恶性胶质瘤，其中Ⅲ级间变型星形细胞瘤的中位生存时间为3年左右，Ⅳ级胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）的中位生存时间仅为14.4个月［2］，年龄＞60岁的患者生存时间更短。分子病因学显示，其发生和发展与多种因素有关［3］，包括原癌基因活化、抑癌基因失活、凋亡相关基因异常、血管活性因子高表达、相关信号转导通路的激活等。胶质瘤作为常见的原发性颅内肿瘤，呈浸润生长且血管丰富，其组织学异质性使得影像学及术中观察很难明确肿瘤范围，无法进行彻底切除［4］。目前，国际上常规应用手术辅以放疗、化疗综合治疗方案，以及靶向治疗如贝伐单抗等药物的使用，但患者的生存质量及预后并不理想。因此，寻找新型抗胶质瘤药物成为近年国内外研究的热点。

绿原酸（chlorogenic acid，CGA）是由反式肉桂酸（trans-cinnamic acids）与奎尼酸（quinic acid）组成的多酚类化合物［5］，包括香豆酰奎尼酸、阿魏酰奎尼酸、咖啡酰奎尼酸（caffeoyl quinic acid，CQA）等分子结构，且存在多种同分异构体如新绿原酸（cryptochloro⁃genic acid，4-CQA）、隐绿原酸（neochlorogenic acid，5-CQA）等，目前仍沿用国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）之前的建议将3-CQA作为绿原酸［6］。绿原酸广泛存在于杜仲、金银花等植物中，作为一种中药提取物，其抗肿瘤作用及分子机制已得到很多实验证实，被认为是癌症的有效化学防护剂［7］。本文将重点归纳绿原酸类物质抗肿瘤作用，尤其是与胶质瘤相关的分子作用机制，并介绍其在胶质瘤治疗中的相关应用及前景。

1 抗胶质瘤分子机制

1.1 调节免疫功能

肿瘤微环境中的免疫系统对肿瘤的形成起到了至关重要的作用，从免疫监视到免疫平衡最终免疫逃逸，肿瘤细胞和微环境的免疫能力此消彼长。Kang等［8］通过表达谱芯片研究绿原酸对于BALB/c EMT-6雌性小鼠的作用，发现与免疫系统调节通路相关的基因CaN和NFAT基因被激活，CaN/NFAT信号通路作用广泛，可以提高Th1型细胞因子（IFN-γ和IL-2）的表达，抑制Th2型细胞因子（IL-4和IL-10）表达，活化T细胞、巨噬细胞、NK细胞和B细胞，从而达到调节免疫作用。

微环境中细胞因子的作用可使巨噬细胞分化成不同状态，M2型巨噬细胞表达多与高级别胶质瘤的不良预后相关，且可能促进肿瘤微环境的形成［9］，而M2型巨噬细胞向M1型转化能够促进抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤细胞的生长和转移，上述现象在肝癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤中均有发现［10］，且与非小细胞肺癌患者生存期延长相关［11］。近期研究表明绿原酸可以通过促进STAT1活化，增加LPS/IFN-γ介导的M1型巨噬细胞相关标记物如iNOS、MHCⅡ和CD11c，同时通过抑制STAT6减少IL-4介导的M2型巨噬细胞标记物Arg和CD206的表达，从而抑制胶质瘤细胞的生长。此外，绿原酸处理的G422小鼠体内CD11c阳性的M1型巨噬细胞比例增加、M2型巨噬细胞减少，其程度与荷瘤小鼠的肿瘤减少重量相一致［12］。

1.2 调节细胞周期且促进细胞凋亡

细胞凋亡的调控包括肿瘤抑制蛋白p53、视网膜细胞瘤（retinoblastoma，RB）蛋白以及Bcl-2蛋白家族成员，恶性胶质瘤细胞中存在这些基因表达的改变，其中以p53的改变最为广泛［13］。p53蛋白是细胞凋亡调控的关键，可使细胞分裂周期静止来促进受损DNA修复，并启动DNA片段化诱导细胞凋亡以防止异常增殖［14］，其生物效应表现为Bax或Bcl-2目标基因的转录调控，而Bcl-2蛋白家族按其功能分为抑制凋亡和促进凋亡两类，其中Bax作为细胞凋亡的促进基因，其过度表达可以使细胞趋于凋亡。Sitarek等［15］分析发现益母草根茎提取物成分中含有绿原酸，将胶质瘤细胞经益母草根茎提取物处理后，流式细胞计数分析发现胶质瘤细胞凋亡增加且呈剂量依赖性，进一步检测凋亡相关基因表达可见p53表达水平上调，同时存在Bcl-2蛋白表达降低以及Bax蛋白水平的显著提高，而Bax/Bcl-2的比例升高更倾向于促进胶质瘤细胞凋亡。由此可见，绿原酸可能增加p53表达，促进损伤DNA的修复，同时上调Bax/Bcl-2比例，介导胶质瘤细胞的凋亡。此外，上述细胞凋亡过程可以避免炎症反应发生及其引起的周围细胞损伤，所以绿原酸抗肿瘤作用的同时无明显不良反应。

1.3 调节代谢并抑制肿瘤细胞侵袭和转移能力

侵袭性和远处转移是恶性肿瘤细胞的本质特性和基本能力，而肿瘤细胞的侵袭能力主要通过基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）降解、破坏细胞外基质和基底膜得以实现。MMP-2作为蛋白溶解酶家族成员，被证实在肿瘤增殖、侵袭过程中扮演重要角色。恶性肿瘤利用葡萄糖的速率高于正常组织，这与其恶性程度及治疗抵抗、不良预后相关。

Belkaid等［16］发现U87胶质瘤细胞高表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PT）mRNA，后者在胶质瘤细胞中可以使葡萄糖在非糖异生组织如脑组织中分解代谢，并调控细胞内信号通路以及侵袭性肿瘤细胞的表型。绿原酸可抑制G6PT活性，阻碍细胞糖酵解途径，使细胞内ATP水平降低，降低MMP-2分泌，从而抑制肿瘤生长、侵袭［17］。此外，绿原酸可通过MT1-MMP/G6PT信号轴抑制S-1-P介导的ERK途径磷酸化［18］，而1-磷脂-神经鞘氨醇（1-phospholipid-sphin⁃gosine，S-1-P）可以有效促进GBM细胞分裂，并通过动员细胞内钙离子诱导细胞外信号调节蛋白磷酸化，引起细胞侵袭和转移。综上，抑制G6PT可以有效地影响肿瘤细胞的侵袭和转移能力，尤其对于高表达G6PT mRNA的恶性肿瘤。作为肿瘤细胞信号通路研究中的新角色，G6PT在肿瘤发生发展过程中的地位以及绿原酸抗胶质瘤细胞的具体作用机制仍值得深入研究。

1.4 抑制肿瘤血管再生

血管生成是肿瘤发展过程中的关键，肿瘤缺氧微环境可经促血管生成因子诱导血管再生，其中缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）在缺氧细胞的应答中起重要作用［19］，涉及肿瘤血管生成过程中许多基因的转录激活。研究表明，绿原酸在低氧条件下可抑制HIF-1α蛋白的表达和功能活性，并有效抑制下游血管内皮生长因子（vascu⁃lar endothelial growth factor，VEGF）表达及其介导的蛋白激酶（AKT）磷酸化过程，从而影响内皮细胞迁移管样结构形成等，最终抑制血管生成。由此可见，绿原酸可以通过下调HIF-1α/AKT途径抑制低氧环境诱导的血管生成［20］，抑制肿瘤增殖。

近年来，绿原酸及其抗肿瘤分子机制得到了广泛而深入的研究，除上述在胶质瘤细胞中的作用外，对于其他肿瘤的相关作用机制研究也多有报道。如绿原酸在白血病细胞中可以通过线粒体膜电位改变、氧自由基（ROS）的产生、Caspase诱导活化促进肿瘤细胞凋亡［21］；近期研究发现绿原酸可干扰人乳腺癌MCF-7细胞周期，阻滞G1期肿瘤细胞并减少S期细胞数，其抗肿瘤作用呈剂量依赖性，IC50值为（52.5±4.72）μg/mL［22］；此外，绿原酸可介导甲基化沉默基因启动子中的CpG岛去甲基化，从而恢复肿瘤细胞中沉默的抑癌基因，表现出抑制DNA甲基化，影响肿瘤细胞表观遗传学的作用［23］。

综上所述，绿原酸抗肿瘤机制不同于传统化疗或靶向等药物，包括抗氧化应激、影响肿瘤细胞的侵袭和远处转移能力、调节免疫系统、干扰细胞周期、抑制血管生成等多重作用，故其交叉耐药可能性低，且有望在临床应用中实现逆转现有抗肿瘤药物的多重耐药性［24］。

2 与传统化疗协同作用

由于肿瘤分子病因机制的复杂性，新型化疗药物及多种药物联合方案仍无法有效改善化疗过程中肿瘤对药物的耐受性，从而导致治疗失败甚至患者死亡，故如何干预、改善肿瘤耐药方式是肿瘤治疗领域的热点及重点。

在宫颈癌A431细胞系中，一定浓度的绿原酸可增加顺铂及奥沙利铂的活性，从而实现协同抗肿瘤作用，经高效液相色谱法分析表明绿原酸在一定浓度时可与顺铂及奥沙利铂形成更有活性的化合物［25］；MMTV-PyVT自发乳腺癌小鼠实验中，拉帕替尼与绿原酸合用有效抑制了乳腺癌的肺转移，这可能与抑制M2型巨噬细胞极化相关［26］。近期研究表明，绿原酸可以增强5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）诱导的肝癌细胞增殖抑制，绿原酸和5-FU的协同作用可能是由于绿原酸诱导的ROS过量产生而使ERK失活［27］，表明绿原酸在肝癌细胞中是5-FU化学疗法的潜在化学增敏剂。

由此可见，在动物实验中绿原酸对多种传统化疗药物均有协同作用，联合用药可通过调节信号通路、参与免疫调节等多种途径提高抑瘤率，降低肿瘤耐药机制，改善现有药物的治疗效果。此外，绿原酸应用于人体或动物实验模型中尚未发现严重不良反应，安全性较高，这些特点均为目前临床治疗提供了有利条件，值得深入研究其抗肿瘤价值。

3 绿原酸在人体内代谢的相关研究

药物在人体内代谢及药效动力学的研究对于最大限度发挥药物效果起着重要作用，已有学者进行了绿原酸以不同给药方式在人体内代谢的相关探索。

人体实验模型表明，口服绿原酸约三分之一在小肠中以原型被吸收，其余进入大肠经微生物代谢分解后吸收［28］，而肠道微生物群落会影响其生物利用度［29］。近期，北京世纪坛医院正在进行绿原酸肌肉注射剂安全性、耐受性和药物代谢动力学特征研究的Ⅰ期临床试验，Ren等［30］分析受试者尿液标本中含有6种代谢物，其中以未代谢的绿原酸及3'-甲基-5-CQA（M3）和4'-甲基-5-CQA（M4）为主，通过反向分子对接分析M3、M4及绿原酸共同作用于RAC丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和DNA复制，且三者均与恶性胶质瘤相关的不同靶点存在相互作用，虽然其具体作用机制尚待明确，但该研究首次阐明了绿原酸代谢产物在治疗恶性胶质瘤中可能存在活性，有助于进行针对性研究并促进绿原酸在治疗恶性胶质瘤领域的应用。

4 结语

胶质瘤是原发于中枢神经系统的肿瘤，其中胶质母细胞瘤患者的生存期很短，预后极差，同时其发生、发展机制十分复杂，传统的临床治疗手段局限且效果欠佳，患者的生存期及生存质量并不理想。近年来，植物提取物绿原酸作为新型抗肿瘤药物受到广泛关注，其抗肿瘤分子机制多样，可通过多种通路及途径实现，且对于乳腺癌、结肠癌等多系统肿瘤有效，作用范围广泛。虽然已有文献报道绿原酸影响脑胶质瘤细胞的增殖和转移、调节免疫系统、协同传统化疗改善疗效等作用，但是目前对于绿原酸抗脑胶质瘤的具体作用机制、联合用药方式及剂量、体内药物代谢等方面的研究尚不成熟，难以用于临床给药，故深入研究绿原酸对于胶质瘤细胞作用的分子机制对于寻找新的抗肿瘤作用靶点、探索药物临床新用途，进而开发利用绿原酸具有重要科学及临床意义。

[1]Dolecek TA,Propp JM,Stroup NE,et al.CBTRUS statistical report:primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005‐2009[J].Neuro Oncol,2013,15(5):646‐647.

[2]Jiang T,Mao Y,Ma W,et al.CGCG clinical practice guidelines for the management of adult diffuse gliomas[J].Cancer Lett,2016,375(2):263‐273.

[3]Strickland M,Stoll EA.Metabolic Reprogramming in Glioma[J].Front Cell Dev Biol,2017,26(5):43.

[4]Lara‐Velazquez M,Al‐Kharboosh R,Jeanneret S,et al.Advances in Brain Tumor Surgery for Glioblastoma in Adults[J].Brain Sci,2017,7(12):166

[5]Wang F,Shang Z,Xu L,et al.Profiling and identification of chloro‐genic acid metabolites in rats by ultra‐high‐performance liquid chromatography coupled with linear ion trap‐Orbitrap mass spec‐trometer[J].Xenobiotica,2017,4:1‐13.

[6]Naveed M,Hejazi V,Abbas M,et al.Chlorogenic acid(CGA):A phar‐macological review and call for further research[J].Biomed Phar‐macother,2018,97:67‐74.

[7]席利莎,木泰华,孙红男.绿原酸类物质的国内外研究进展[J].核农学报,2014,28(2):292‐301.

[8]Kang TY,Yang HR,Zhang J,et al.Corrigendum to"The Studies of Chlorogenic Acid Antitumor Mechanism by Gene Chip Detection:The Immune Pathway Gene Expression"[J].J Anal Methods Chem,2015,2015:538539.

[9]Sørensen MD,Dahlrot RH,Boldt HB,et al.Tumor‐associated mi‐croglia/macrophages predict poor prognosis in high‐grade gliomas and correlate with an aggressive tumor subtype[J].Neuropathol Appl Neurobiol,2018,44(2):185‐206.

[10]Zhang M,Hutter G,Kahn SA,et al.Anti‐CD47 Treatment Stimulates Phagocytosis of Glioblastoma by M1 and M2 Polarized Macro‐phages and Promotes M1 Polarized Macrophages In Vivo[J].PloS one,2016,11(4):e0153550.

[11]Dai F,Yu N,Che G,et al.The M1 form of tumor‐associated macro‐phages in non‐small cell lung cancer is positively associated with survival time[J].BMC Cancer,2010,10(1):112.

[12]Xue N,Zhou Q,Ji M,et al.Chlorogenic acid inhibits glioblastoma growth through repolarizating macrophage from M2 to M1 pheno‐type[J].Sci Rep,2017,3(7):39011.

[13]Zheng H,Ying H,Yan H,et al.p53 and Pten control neural and glio‐ma stem/progenitor cell renewal and differentiation[J].Nature,2008,455(7216):1129‐1133.

[14]Beyfuss K,Hood DA.A systematic review of p53 regulation of oxida‐tive stress in skeletal muscle[J].Redox Rep,2018,23(1):100‐117.

[15]Sitarek P,Skała E,Toma M,et al.A preliminary study of apoptosis in‐duction in glioma cells via alteration of the Bax/Bcl‐2‐p53 axis by transformed and non‐transformed root extracts of Leonurus sibiri‐cus L[J].Tumor Biol,2016,37(7):8753‐8764.

[16]Belkaid A,Copland IB,Massillon D,et al.Silencing of the human mi‐crosomal glucose‐6‐phosphate translocase induces glioma cell death:Potential new anticancer target for curcumin[J].FEBS Lett,2006,580(15):3746‐3752.

[17]Abbadi S,Rodarte JJ,Abutaleb A,et al.Glucose‐6‐phosphatase is a key metabolic regulator of glioblastoma invasion[J].Mol Cancer Res,2014,12(11):1547‐1559.

[18]Fortier S,Labelle D,Sina A,et al.Silencing of the MT1‐MMP/G6PT axis suppresses calcium mobilization by sphingosine‐1‐phosphate in glioblastoma cells.[J].FEBS Lett,2008,582(5):799‐804.

[19]Thirusangu P,Vigneshwaran V,Ranganatha VL,et al.A tumoural an‐giogenic gateway blocker,Benzophenone‐1B represses the HIF‐1α nuclear translocation and its target gene activation against neoplas‐tic progression[J].Biochem Pharmacol,2016,125:26‐40.

[20]Park JJ,Hwang SJ,Park JH,et al.Chlorogenic acid inhibits hypoxia‐induced angiogenesis via down‐regulation of the HIF‐1α/AKT path‐way[J].Cell Oncol,2015,38(2):111‐118.

[21]Yang JS,Liu CW,Ma YS,et al.Chlorogenic acid induces apoptotic cell death in U937 leukemia cells through caspase‐and mitochon‐dria‐dependent pathways[J].In Vivo,2012,26(6):971‐978.

[22]Deka SJ,Gorai S,Manna D,et al.Evidence of PKC Binding and Trans‐location to explain the anticancer mechanism of chlorogenic acid in breast cancer cells[J].Curr Mol Med,2017,17(1):79‐89.

[23]Lewandowska H,Kalinowska M,Lewandowski W,et al.The role of natural polyphenols in cell signaling and cytoprotection against cancer development[J].J Nutr Biochem,2016,32:1‐19.

[24]Sertel S,Eichhorn T,Sieber S,et al.Factors determining sensitivity or resistance of tumor cell lines towards artesunate[J].Chem Biol Interact,2010,185(1):42‐52.

[25]Catanzaro D,Filippini R,Vianello C,et al.Chlorogenic Acid Interac‐tion with Cisplatin and Oxaliplatin:Studies in Cervical Carcinoma Cells[J].Nat Prod Commun,2016,11(4):499‐502.

[26]Zhang JQ,Yao ZT,Liang GK,et al.Combination of lapatinib with chlorogenic acid inhibits breast cancer metastasis by suppressing macrophage M2 polarization[J].Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban,2015,44(5):493‐499.

[27]Yan Y,Li J,Han J,et al.Chlorogenic acid enhances the effects of 5‐fluorouracil in human hepatocellular carcinoma cells through the inhibition of extracellular signal‐regulated kinases[J].Anticancer Drugs,2015,26(5):540‐546.

[28]Stalmach A,Mullen W,Barron D,et al.Metabolite profiling of hy‐droxycinnamate derivatives in plasma and urine after the ingestion of coffee by humans:identification of biomarkers of coffee con‐sumption[J].Drug Metab Dispos,2009,37(8):1749‐1758.

[29]Renouf M,Marmet C,Giuffrida F,et al.Dose‐response plasma ap‐pearance of coffee chlorogenic and phenolic acids in adults[J].Mol Nutr Food Res,2014,58(2):301‐309.

[30]Ren T,Wang Y,Wang C,et al.Isolation and identification of human metabolites from a novel anti‐tumor candidate drug 5‐chlorogenic acid injection by HPLC‐HRMS/MSn and HPLC‐SPE‐NMR[J].Anal Bio‐anal Chem,2017,409(30):7035‐7048.