三醇皂苷中人参皂苷Rg1的分离纯化工艺研究

李滢 张敏 高宏涛

摘要：目的 优选三醇皂苷中高纯度人参皂苷Rg1的中压制备工艺条件。方法 采用反相C18色谱中压制备方法，以人参皂苷Rg1的纯度及收率为指标进行考察。结果 C18色谱柱径高比为1：3.25，以20%乙醇上样0.2倍柱体积的三醇皂苷、以8 BV/h 的洗脱流速用30%、30%-40%、40%乙醇分别洗脱1、3、0.5个柱体积，浓缩得人参皂苷Rg1粗品，加入4倍体积的95%乙醇溶解，之后加入0.5%的活性炭热回流40 min，干燥得人参皂苷Rg1精品。结论 经纯化后可以從三醇皂苷中分离得到纯度高于99.5%的人参皂苷Rg1。本文首次提供了纯度高于99.5%的人参皂苷Rg1的中压制备工艺，经多次试验验证该工艺稳定可行且重复性好，可用于工业化放大生产。

关键词：三醇皂苷；人参皂苷Rg1；纯化工艺

中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2018）11-0069-03

【Abstract】Objective： To optimize the medium pressure preparation process conditions of high purity ginsenoside Rg1 in triol saponins. Methods： The reversed-phase C18 chromatographic preparation method was used to investigate the purity and yield of ginsenoside Rg1. Results： The diameter-to-height ratio of C18 column was 1：3.25. The triol saponin of 0.2 times column volume loaded with 20% ethanol and the elution flow rate with 30%， 30%-40%， 40% ethanol were separately eluted to 1， 3， 0.5 column volumes at 8 BV/h. The crude ginsenoside Rg1 was concentrated and dissolved in 4 volumes of 95% ethanol. Then， 0.5% activated carbon was heated and refluxed for 40 min， and dried to obtain good quality higinsenoside Rg1. Conclusion： After purification， ginsenoside Rg1 with purity higher than 99.5% can be isolated from triol saponin. This medium-pressure preparation process of ginsenoside Rg1 with purity higher than 99.5% is provided for the first time. It has been proved by many experiments that the process is stable， feasible and reproducible， and can be used for industrial scale-up production.

【Key words】triol saponin， ginsenoside Rg1， purification process

三七为五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen 的干燥根和根茎，由于其具有显著的止血化瘀作用，三七及其提取物在心脑血管治疗及预防方面均在国际市场占有一席之地。皂苷是三七的主要有效成分之一，研究表明，人参皂苷Rg1占三七总皂苷量的20%，且具有抗焦虑、抗癫痫[1]、改善阿尔兹海默症认知能力[2]、减少缺血性/再灌注心律失常的发生率及心肌梗死面积[3]、治疗肌萎缩等药理作用[4]，这使其在防治心脑血管疾病方面具有极大的潜在临床应用价值。本试验采用单因素多水平试验，以人参皂苷Rg1的纯度及收率为指标，优选出了人参皂苷Rg1的最佳反相（C18硅胶色谱）中压制备工艺条件。本研究提供了纯度高于99.5%的人参皂苷Rg1纯化工艺，为人参皂苷Rg1的进一步研究开发提供了物质基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 美国戴安U3000型高效液相色谱仪；梅特勒XP-205 型分析天平；Ulupure 超纯水制备系统（成都超纯）；日本山善株式会社YFLC-AI-700中低压制备色谱。

1.2 材料 人参皂苷Rg1对照品（批号：110703-201529）中国食品药品检定研究院；三醇皂苷（批号：2015003）昆药集团股份有限公司药物研究院自制；C18反相硅胶（苏州纳微科技有限公司）；安捷伦Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；甲醇、乙腈均为色谱纯（德国默克公司）；甲醇、乙醇为分析纯；全部实验用水均为超纯水制造系统制备的电阻率大于 18.25 MΩ·cm的超纯水。

2 方法与结果

2.1 人参皂苷Rg1含量测定方法的建立

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称定三七总皂苷对照提取物适量，加70%甲醇溶液制成每1 mL含2.5 mg的溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 取本品25 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.1.3 色谱条件 色谱柱：安捷伦Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速：1.5 mL/min；检测波长203 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μl；理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于6000。

2.2 三醇皂苷中人参皂苷Rg1的分离

2.2.1 人参皂苷Rg1纯化条件的筛选 取反相C18色谱柱（50 μm，20*250 mm），采用中低压制备色谱仪，考察乙醇浓度在20-45%之间梯度洗脱所得有效成分人参皂苷Rg1的纯度及收率。分别上样2 g三醇皂苷（人参皂苷Rg1含量：1.12 mg/mL），洗脱梯度如下表2～5，结果见表6。

从试验结果可知，条件2洗脱所得人参皂苷Rg1纯度最高，但收率较低，仅有76.70%；条件4洗脱所得人参皂苷Rg1收率最大，且纯度较高为89.88%，与条件2洗脱最高纯度90.25%相差不大，因此选择条件4作为最适洗脱条件。

2.2.2 上样量的选择 取反相C18色谱柱（50 μm，20*65 mm，20 mL），分别上样2（0.1 BV）、3（0.15 BV）、4（0.2 BV）g，以20%乙醇上样、30%、30-40%、40%乙醇分别洗脱1、3、0.5个柱体积，检测洗脱液中人参皂苷Rg1的纯度，筛选出最优上样量。结果见表7。

根据上述试验结果可以看出，当上样4（0.2 BV）g时，分离得到的人参皂苷Rg1的纯度及收率均最高，因此选择上样4（0.2 BV）g为最适上样量。

2.2.3 洗脱流速的选择 取反相C18色谱柱（50 μm，20*65 mm，20 mL），上样4（0.2 BV）g，以20%乙醇上样、30%、30-40%、40%乙醇分别洗脱1、3、0.5个柱體积，洗脱流速分别为6、7、8 BV/h。测定洗脱液中人参皂苷Rg1的纯度，结果见表8。

试验结果显示，随着洗脱流速的增加，洗脱液中人参皂苷Rg1的纯度不断降低，但收率不断升高，洗脱流速8 BV/h所得人参皂苷Rg1收率最高，且纯度较7 BV/h洗脱所得相差不大，因此选择洗脱流速8 BV/h作为最适洗脱流速。

2.2.4 精制条件的筛选 通过之前的试验可以获得纯度为90%左右的人参皂苷Rg1粗品，拟采用活性炭精制的方法以获得纯度高于99%的人参皂苷Rg1。

2.2.4.1 溶剂倍数的选择 取100 mL三角瓶4个，各加入5 g的人参皂苷Rg1粗品，之后分别加入20、30、40、50 mL的95%乙醇，60 ℃水浴溶解，记录溶解所需时间，见有9。

从上述试验结果可以看出，20 mL（4倍体积）95%乙醇溶解人参皂苷Rg1粗品用时最短，因此选择4倍95%乙醇作为最优溶解溶剂。

2.2.4.2 加活性炭量的选择 取100 mL三角瓶3个，各加入5 g的人参皂苷Rg1粗品，加入20 mL（4倍体积）95%乙醇，60 ℃水浴溶解，之后分别加入0.3%、0.5%、1%的活性炭，70 ℃水浴回流30 min，趁热过滤，滤液减压回收溶剂，测定人参皂苷Rg1纯度，见表10。

从上表可以看出，选取人参皂苷Rg1纯度及收率最高的实验条件，即加活性炭0.5%为最优加活性炭的量。

2.2.4.3 回流时间的选择 取100 mL三角瓶5个，各加入5 g的人参皂苷Rg1粗品，加入20 mL（4倍体积）95%乙醇，60 ℃水浴溶解，加入0.5%活性炭，70 ℃水浴分别回流10、20、30、40、60 min，趁热过滤，滤液减压回收溶剂，测定人参皂苷Rg1纯度，见表11。

从表中可以看出，回流60 min所得人参皂苷Rg1纯度及收率均最高，但与回流40 min所得人参皂苷Rg1纯度及收率相比相差不大，且节约了时间，降低了生产成本，因此选取回流40 min为最优条件。

2.3 工艺验证试验 取反相C18色谱柱（200 mL，径高比为1：3.25）上样40 g（0.2 BV），之后以20%乙醇上样、以8 BV/h 的洗脱流速用30%、30-40%、40%乙醇分别洗脱1、3、0.5个柱体积，浓缩得人参皂苷Rg1粗品，加入4倍体积的95%乙醇溶解，之后加入0.5%的活性炭热回流40 min，得人参皂苷Rg1精品，测量其纯度。结果见表12。

试验结果表明，该纯化工艺可以将三醇皂苷中的色素及Rb1有效剔除，通过精制工艺之后得到的人参皂苷Rg1纯度在99.5%以上，且转移率大于90%，表明该工艺稳定可行。

3 讨论

本研究首次提供了纯度99.5%以上的人参皂苷Rg1的分离纯化工艺。通过对比不同工艺参数，以人参皂苷Rg1的纯度及转移率为标准，确定了人参皂苷Rg1反相C18色谱中压制备纯化工艺条件为：反相C18色谱柱径高比为1：3.25，以20%乙醇上样、以8 BV/h 的洗脱流速以20%乙醇上样、30%、30-40%、40%乙醇分别洗脱1、3、0.5个柱体积，浓缩得人参皂苷Rg1粗品，加入4倍体积的95%乙醇溶解，之后加入0.5%的活性炭热回流40 min，得人参皂苷Rg1精品。

经验证，采用C18色谱中压制备分离纯化技术，可有效从三醇皂苷中分离得到纯度高于99.5%的人参皂苷Rg1，该工艺条件及参数可行且重复性好，可用于进一步的工业化生产，为其进一步研究提供了物质基础，也为其临床用药价值提供了技术支持。

参考文献：

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[3]宋达，魏鑫，袁云云，等.人参皂苷Rg1对大鼠缺血性/再灌注心律失常的作用[J].临床心血管病杂志，2017，33（5）：465-469.

[4]李凤玉，贾胜男，马爽，等.人参皂苷Rg1抑制C2C12细胞MuRF-1/Atrogin-1表达研究[J].长春师范大学学报，2017，36（2）：65-70.