黑果枸杞酚性成分研究△

程礼芝，郭平霞，戴伟峰，晏永明，刘宝华，王淑美，程永现，*

（1.广东药科大学，广东 广州 510006；2.深圳大学医学部药学院，广东 深圳 518060；3.中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室，云南 昆明 650201；4.深圳大学医学部生物化学与分子生物学系，广东 深圳 518060）

黑果枸杞Lycium ruthenicum Murr.为茄科枸杞属多年生灌木，简称黑枸杞，果实黑色，是一种药食两用植物，在我国主要分布于西北地区，尤以青海产的质量最优。藏药称黑果枸杞为 “旁玛”，其味甘、性平，清心热，用于治疗心热病、心脏病、月经异常、停经等病症，民间常生食或榨汁做饮料，具有滋补强壮、明目及降血压作用［1-2］。现代药理研究表明，黑果枸杞具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力等作用［2-5］。其化学成分研究比较薄弱，已有研究主要集中于花色苷、原花青素、生物碱类和酚性化合物［2-8］。黑果枸杞含有丰富的维生素、矿物质等营养成分，其原花青素含量很高，是目前发现的天然野生果实中花青素含量最高的植物，原花青素具有很好的清除自由基和抗氧化作用，因此黑果枸杞近年来在保健品开发市场异常活跃［9］，逐渐被公众所熟知，其价格也是不断上涨。由于野生资源的匮乏，人工栽培种植也逐渐成规模，这为充分利用这一天然资源提供了保障。鉴于此，本研究主要对黑果枸杞物质基础进行研究，从中共分离鉴定化合物14个，其中化合物1～4、7、9和14为首次从该植物中分离得到，并对化合物1和2进行了抗衰老相关因子SIRT1和SIRT6的体外活性测试。

1 仪器与材料

薄层色谱硅胶GF254（青岛海洋化工厂）；MCI gel CHP 20P（75～150μm，日本三菱公司）；Sephadex LH-20（25～100μm，Pharmacia公司）；RP-18（40～63μm，日本 Daiso）；北京创新通恒 LC3000型HPLC和Agilent 1200型HPLC，半制备色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×9.4 mm，5μm）和YMC-Pack-ODS-A（250 mm×10 mm，5μm）；Bruker AvanceⅢ400MHz、500MHz和Bruker Avance 600 MHz核磁共振仪（TMS为内标）；Xevo TQ-S超高压液相色谱三重四级杆串联质谱联用仪；PerkinElmer En-Spire型多通道酶标仪；SIRT1 Fluorometric Drug Discovery Kit（Enzo公司）；CycLex SIRT6 Deacetylase Fluorometric Assay Kit（MEDICAL＆ BIOLOGICAL LABORATORIES，MBL公司）。

黑果枸杞样品由青海大可生物科技有限公司提供，经云南省药物研究所高级工程师邱斌鉴定为黑果枸杞Lycium ruthenicum Murr.的干燥果实，凭证标本（编号：CHYX0605Q）保存于中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室。

2 方法

2.1 提取与分离

黑果枸杞5 kg，80%乙醇水回流提取（3×2 h），每次6倍体积，提取液用盐酸调pH为1～2，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，各3次，分别记为A和B部分。A部分（52.5 g）经MCI gel CHP 20P柱（甲醇-水，10%～100%）分为7段（F1～F7）。F1（1.5 g）经Sephadex LH-20（甲醇）色谱得3个组分（F1.1～F1.3）。F1.1（500 mg）经制备薄层色谱 ［三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶1∶0.1）］再行半制备 HPLC［乙腈-水（含5‰甲酸），20%］得化合物8（3 mg）、2（1.1 mg）和 7（7.9 mg）。F1.2（500 mg）经制备薄层色谱 ［三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶1∶0.1））再行半制备 HPLC［甲醇-水（含5‰甲酸），45%］得化合物1（2.4 mg）和 9（3.7 mg）。F4（2.5 g）经 Sephadex LH-20（甲醇）色谱得6个组分（F4.1～F4.6）。F4.1（600 mg）经制备薄层色谱 ［三氯甲烷-甲醇-甲酸（9∶1∶0.05）］得 5个组分（F4.1.1～F4.1.5），F4.1.4（50 mg）经半制备HPLC（乙腈-水，15%）得化合物10（2 mg）、4（4.1 mg）和3（2.5 mg）。F4.1.5（80 mg）经半制备 HPLC（乙腈-水，20%）得化合物12（1.6 mg）、13（4.5 mg）和14（3.5 mg）。F4.3（200 mg）经制备薄层色谱 ［三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶1∶0.1）］，再行半制备 HPLC（乙腈-水，25%）得化合物 5（2.2 mg），6（2.4 mg）和 11（1.9 mg）。

2.2 SIRT1体外活性测试

本实验利用SIRT1 Fluorometric Drug Discovery Kit以检测化合物对SIRT1体外活性的影响。首先，配制含0.5 U（1 U＝1 pmol·min-1，37℃）SIRT1（除空白组外），1000μmol·L-1NAD+，100μmol·L-1去乙酰酶底物，SIRT1缓冲液（50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，137mmol·L-1NaCl，2.7mmol·L-1KCl，1 mmol·L-1MgCl2，1 mg·mL-1BSA）的体系。实验组加入待检测化合物，使化合物终浓度为200μmol·L-1，空白组与对照组加入等量溶解化合物的溶剂；再加入已配好的体系，使加入待检测化合物与体系的总体积为25μL。37℃条件下孵育30 min后于每个孔中加入1×Fluor de Lys developer solution（含有2 mmol·L-1烟酰胺）25μL终止反应，反应在半区96孔板中进行。多功能酶标仪360 nm激发光，460 nm发射光条件下测取各孔荧光值。

2.3 SIRT6体外活性测试

本实验利用CycLex SIRT6 Deacetylase Fluorometric Assay Kit检测化合物对SIRT6体外活性的影响。检测体系中含2.5μL带有荧光基团和淬灭基团的底物多肽（0.1mmol·L-1），2.5μL NAD（8mmol·L-1），2.5μL Developer，2.5μL重组 SIRT6（空白组除外）以及2.5μL SIRT6实验缓冲液。实验组加入待检测化合物，使化合物终浓度为200μmol·L-1，反应体系总体积为25μL。空白与对照组加入等量的溶解化合物的溶剂，实验在半区96孔板中进行。多功能酶标仪于37℃、490 nm激发光，530 nm发射光条件下测取各孔荧光值。

3 结果

3.1 化合物结构鉴定

化合物1：淡黄色固体，ESI-MS：m／z299［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：9.81（1H，s，H-7′），7.55（1H，brs，H-2′），7.42（1H，brs，H-6′），6.97（1H，d，J＝1.6 Hz，H-2），6.85（1H，d，J＝8.0，1.6 Hz，H-6），6.81（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），5.69（1H，d，J＝6.5 Hz，H-7），3.89（2H，d，J＝5.9 Hz，H-9），3.96（3H，s，5′-OCH3），3.85（3H，s，3-OCH3），3.64（1H，m，H-8）。以上数据和文献基本一致［10］，故确定化合物1为榕醛。

化合物2：淡黄色固体，ESI-MS：m／z345［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.23（1H，d，J＝1.9 Hz，H-3），6.01（1H，d，J＝1.9 Hz，H-5），4.90（1H，overlap，H-1′），3.90（1H，dd，J＝12.2，1.5 Hz，Ha-6′），3.87（3H，s，7-OCH3），3.71（1H，dd，J＝12.2，4.8 Hz，Hb-6′），3.30～3.52（4H，overlap，H-2′，3′，4′，5′）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：98.7（C-1），164.8（C-2），96.6（C-3），165.0（C-4），98.3（C-5），161.2（C-6），172.0（C-7），102.5（C-1′），74.9（C-2′），78.0（C-3′），71.2（C-4′），78.4（C-5′），62.4（C-6′），52.6（7-OMe）。以上数据和文献基本一致［11］，故确定化合物2为4，6-二羟基苯甲酸甲酯-2-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物3：淡黄色固体，ESI-MS：m／z177［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.78（1H，d，J＝9.4 Hz，H-4），6.94（1H，s，H-5），6.75（1H，s，H-8），6.18（1H，d，J＝9.4 Hz，H-3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：164.3（C-2），112.8（C-3），146.1（C-4），112.5（C-4a），113.0（C-5），144.6（C-6），152.1（C-7），103.6（C-8），150.5（C-8a）。以上数据和文献对照基本一致［12］，故确定化合物3为马栗树皮素。

化合物4：淡黄色固体，ESI-MS：m／z325［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.73（1H，d，J＝15.8 Hz，H-7），7.48（2H，d，J＝8.5 Hz，H-2，H-6），6.81（2H，d，J＝8.5 Hz，H-3，H-5），6.37（1H，d，J＝15.8 Hz，H-8），5.57（1H，d，J＝7.6 Hz，H-1′），3.85（1H，dd，J＝12.2，1.9 Hz，Ha-6′），3.69（1H，dd，J＝12.2，4.6 Hz，Hb-6′），3.30～3.48（4H，overlap，H-2′，3′，4′，5′）。以上数据和文献对照基本一致［13］，故确定化合物4为对羟基肉桂酸葡萄糖酯。

化合物5：淡黄色固体，ESI-MS：m／z193［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.59（1H，d，J＝15.8 Hz，H-7），7.18（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2），7.06（1H，dd，J＝8.2，2.0 Hz，H-6），6.81（1H，d，J＝8.2 Hz，H-5），6.31（1H，d，J＝15.8 Hz，H-8），3.89（3H，s，3-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：167.5（s，C-9），149.3（s，C-3），147.8（s，C-4），145.2（d，C-7），126.3（C-1），123.4（C-6），115.2（C-5），114.7（C-8），110.0（C-2），55.6（3-OCH3）。以上数据和文献对照基本一致［14］，故确定化合物5为反式阿魏酸。

化合物6：淡黄色固体，ESI-MS：m／z179［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.53（1H，d，J＝15.8 Hz，H-7），7.04（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2），6.93（1H，dd，J＝8.2，2.0 Hz，H-6），6.78（1H，d，J＝8.2 Hz，H-5），6.22（1H，d，J＝15.8 Hz，H-8）。以上数据和文献对照基本一致［15］，故确定化合物6为反式咖啡酸。

化合物7：淡黄色固体，ESI-MS：m／z177［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.63（1H，d，J＝15.9 Hz，H-7），7.47（2H，d，J＝8.6 Hz，H-2，H-6），6.82（2H，d，J＝8.6 Hz，H-3，H-5），6.34（1H，d，J＝15.9 Hz，H-8），3.77（3H，s，4-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：172.2（C-9），160.3（C-4），145.4（C-7），131.2（C-2，C-6），128.5（C-1），117.1（C-8），114.9（C-3，C-5），56.3（4-OCH3）。以上数据和文献对照基本一致［16］，故确定化合物7为对甲氧基桂皮酸。

化合物8：淡黄色固体，ESI-MS：m／z163［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.55（2H，d，J＝8.6 Hz，H-2，H-6），6.90（2H，d，J＝8.6 Hz，H-3，H-5），7.62（1H，d，J＝16.0 Hz，H-7），6.34（1H，d，J＝16.0 Hz，H-8）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：126.3（C-1），130.0（C-2，C-6），115.3（C-3，C-5），157.8（C-4），145.2（C-7），114.7（C-8），167.5（C-9）。以上数据和文献对照基本一致［14］，故确定化合物8为对羟基桂皮酸。

化合物9：淡黄色固体，ESI-MS：m／z209［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.77（1H，d，J＝1.6 Hz，H-2），6.69（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），6.62（1H，dd，J＝8.0，1.6 Hz，H-6），3.84（3H，s，3-OCH3），3.63（3H，s，9-OCH3），2.59（2H，t，J＝7.6 Hz，H-8），2.87（2H，t，J＝7.6 Hz，H-7）。以上数据和文献基本一致［17］，故确定化合物9为二氢阿魏酸甲酯。

化合物10：淡黄色固体，ESI-MS m／z：167［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.44（1H，dd，J＝7.5，1.6 Hz，H-6），6.74（1H，d，J＝7.5 Hz，H-5），7.54（1H，d，J＝1.6 Hz，H-2），3.85（3H，s，3-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：122.2（C-1），113.7（C-2），149.4（C-3），147.6（C-4），114.8（C-5），123.9（C-6），171.2（C-7），56.1（3-OCH3）。以上数据和文献对照基本一致［18］，故确定化合物10为香草酸。

化合物11：淡黄色固体，ESI-MS：m／z 153［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.45（1H，d，J＝1.9 Hz，H-2），7.43（1H，dd，J＝8.0，1.9 Hz，H-6），6.81（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：121.7（C-1），122.5（C-2），144.7（C-3），150.1（C-4），114.3（C-5），116.3（C-6），168.8（C-7）。以上数据和文献对照基本一致［19］，故确定化合物11为原儿茶酸。

化合物12：白色固体，ESI-MS：m／z137［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.83（1H，d，J＝7.4 Hz，H-2，H-6），6.76（1H，d，J＝7.4 Hz，H-3，H-5）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：128.0（C-1），132.4（C-2，C-6），115.4（C-3，C-5），161.3（C-4），171.2（C-7）。以上数据和文献对照基本一致［20］，故确定化合物12为对羟基苯甲酸。

化合物13：淡黄色固体，ESI-MS：m／z137［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：9.69（1H，s，H-7），7.30（1H，dd，J＝1.9 Hz，H-2），7.28（1H，d，J＝7.8，1.9 Hz，H-6），6.91（1H，d，J＝7.8 Hz，H-5）。以上数据和文献对照基本一致［21］，故确定化合物13为原儿茶醛。

化合物14：白色固体，ESI-MS m／z：129［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：6.81（1H，d，J＝15.9 Hz，H-3），6.76（1H，d，J＝15.9 Hz，H-2），3.79（3H，s，1-OCH3）。以上数据和文献对照基本一致［22］，故确定化合物14为（E）-2-丁烯二酸单甲酯。

3.2 活性测试

对抗衰老的自然过程一直是人类科学研究的焦点，黑果枸杞主要用于抗氧化和抗衰老，对其的开发和利用引起了人们广泛关注和重视。近年来发现长寿基因SIRT1去乙酰化酶在延缓生物体衰老过程中扮演着十分重要的角色，SIRT6通过干预基因组的稳定性而影响衰老进程，由于化合物3～13的结构为常见酚性化合物，因此，我们仅对分离得到的化合物1和2进行了SIRT1和SIRT6体外活性测试，遗憾的是，这两个化合物并未显示活性。鉴于黑果构杞本身对抗衰老的作用，因此可以预见其中的其他化合物可能是其抗衰老的物质基础。

4 结论与讨论

黑果枸杞的开发利用近年逐渐升温，其甚至被誉为 “软黄金”美誉，但是其药效物质基础研究还很薄弱，我们本次报道分离得到的14个酚性化合物，其中化合物1～4、7、9和14为首次从黑果枸杞中分离得到，此外对化合物1和2也进行了抗衰老相关的SIRT1和SIRT6体外活性测试，虽然未显示出相关活性，可以预见其中的其他化合物可能是其抗衰老的物质基础，值得进一步挖掘。

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