动物细小病毒致病机制的研究进展

杨一鸣，姜 萌，鄢雨晴，何天琦，董 浩

(吉林农业大学 生命科学学院，吉林 长春 130118)

细小病毒是一类目前发现存在于自然界中形态最小的动物病毒，该病毒表面无囊膜，由正二十面体的衣壳包裹[1]。该病毒现已呈世界性感染，自然感染宿主范围广泛。目前感染较为广泛的几种细小病毒包括猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)、犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)、猫细小病毒(Feline parvovirus，FPV)和鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)。

猪细小病毒是由Mary和Mahnel在1966年首次发现，主要感染动物是猪，可引起母猪发生繁殖障碍病，其在猪群中检出率甚高，是目前导致胚胎和胎儿死亡的主要病毒。当前研究发现，感染PPV后可导致仔猪腹泻、发生皮炎及呼吸系统疾病，同时与多种疾病有关，如仔猪断奶多系统衰竭综合征、猪非化脓性心肌炎和猪消瘦综合症。PPV在猪群中的血清抗体阳性率高达50%～80%，因此给养猪业造成了巨大的经济损失[2]，严重影响和制约着养猪业的发展。

犬细小病毒最早是在1977年由美国学者Eugster和Nairnl发现，该病毒自发现以来就一直在世界范围内传播。研究发现，CPV从抗原性角度与FPV关系密切，当前研究表明因突变而产生。在体外环境下，FPV只可感染组织培养的猫细胞，而CPV-2可致使组织培养的犬细胞和猫细胞感染，但无法感染猫。CPV与FPV在DNA序列上同源性高达99%，因此，学者们普遍认为，CPV是由FPV发生基因突变而产生的。CPV对于不同年龄及品种的犬都易感，且死亡率高达20%～100%[3]，给当前养犬业带来巨大的危害[4]。

猫细小病毒在1928年被Verge等学者首次发现，后分别在1957年、1964年被Bilin、Johnson分离出来，目前已在世界各地广泛分布和传播。FPV是一种典型的肉食兽细小病毒，其感染范围大，包括猫及其他猫科成员、熊科动物(如浣熊、大熊猫等)、臭鼬、水貂、狐狸等[5-6]。FPV对感染动物并无年龄限制，但幼猫易感性最强，感染该病的幼猫死亡率可高达90%以上，且该病的传染性极强，经常使整窝幼猫同时发病或陆续发病。

鹅细小病毒在1956年被我国学者方定一首次发现，由匈牙利学者Derzsy在1966年首次公开并在1971年确定小鹅瘟病原为GPV[7]，在1995年Zadori等学者获得其全基因组序列。研究发现，该病毒可在雏鹅及雏番鸭群中引起小鹅瘟病，但对其他禽类及哺乳动物尚未发现感染性。其致病性及死亡率极高，是养鹅业中极为重视的疾病之一[8]。由于该病所造成的经济损失较为严重，所以自发现以来对小鹅瘟的研究和防控做了大量的研究工作。

作为当前研究的热点，动物细小病毒致病机制研究成果较少，为了更好地了解动物细小病毒及其致病机制，对4种动物细小病毒致病机制研究成果进行整理，为动物细小病毒研究提供一些借鉴。

1 4种细小病毒病原学

细小病毒不具有囊膜，含有球形20面体对称衣壳，为单股DNA病毒。病毒粒子呈六角形或圆形[9]。

1.1 猪细小病毒

PPV直径为20～28 nm，核衣壳由32个壳粒组成。可凝集人、猴、猫、鸡、小鼠、豚鼠等动物的红细胞。相对于一般的病毒，PPV对高温和酸碱性环境的抵抗力较强。在56 ℃环境下加热48 h，病毒传染性、凝集红细胞能力均无明显变化。在70 ℃条件下加热2 h，病毒仍存在感染力但有所下降。在80 ℃条件下加热5 min后观察发现，PPV失去活性。在甲醛蒸汽情况下需较长时间才可灭活，在20% NaOH溶液中需至少5 min，或在0.5%漂白粉及2% NaOH溶液中5 min，或在3%甲醛溶液中1 h可灭活[10]。

1.2 犬细小病毒

CPV直径为20 nm，其抗原性与猫细小病毒及水貂肠炎病毒关系密切。在4 ℃条件下可使猪、恒河猴的红细胞发生凝集。CPV具有很强的抵抗力，对于大多数的理化因素及试剂抗性都较强。在4～10 ℃环境下可存活6个月，在37 ℃环境下可存活2周左右，在56 ℃下可存活24 h，80 ℃条件下可存活15 min。CPV在粪便中可存活数月甚至数年之久。CPV对于乙醚、氯仿有机溶剂及醇类试剂有着一定的抵抗力，但对于紫外线、福尔马林、甲醛、次氯酸钠、氧化剂较为敏感。

1.3 猫细小病毒

FPV直径为20～24 nm。FPV在4 ℃、pH值为6.5～6.8环境中对猪红细胞凝集，pH值过低时会出现红细胞自凝现象，该情况下需加入0.05%的牛血白蛋白或0.5%灭活的兔血清作为稳定剂。FPV具有较强抵抗力，在65 ℃环境中加热30 min不会完全失去活力。对于酸、碱、酚、乙醚、胰蛋白、氯仿及丙酮等脂溶性溶剂均有抵抗力。使用0.5%的福尔马林和0.175%的次氯酸钠可有效地灭活病毒。

1.4 鹅细小病毒

GPV直径为20～25 nm。根据国外学者报道，GPV可使黄牛的精子凝集。不能凝集鸡、鸭、鹅、羊、兔、豚鼠和小鼠的红细胞[11]。GPV在不良环境下的抵抗力较强，在37 ℃、pH值3.0环境下作用1 h，仍能保持其感染性。在56 ℃环境中3 h，仍具有活性[12]。GPV对乙醚和脂溶性试剂不敏感。

2 4种细小病毒分子生物学特征

细小病毒的基因组中主要的开放阅读框架有2个，分别为3′端编码的结构蛋白VP与5′端编码的非结构蛋白NS。

2.1 猪细小病毒

PPV基因组长度约为5 000 bp，基因组两端均有发夹结构。PPV两端均为回文结构，5′端长度为127 bp，形成U形结构，3′端长度为102 bp，形成Y形结构。Molitor等[12]研究表明，PPV无论毒株强弱在VP2基因759—917位点处均有连续的158个碱基，该段基因序列为PPV所特有。VP2是PPV主要的衣壳蛋白，通过研究表明，缺失VP2蛋白的突变体会导致病毒丧失对宿主细胞的再感染能力[13]。通过研究分析，NS1作为PPV的反式激活蛋白，在病毒的复制和转录中起到至关重要的作用，特别是NS1的磷酸化及糖基化功能。

2.2 犬细小病毒

CPV基因组中含有2个转录启动子，分别为P4和P38启动子，P4启动子主要负责转录非结构蛋白NS1及NS2，P38启动子主要负责转录结构蛋白VP1及VP2。CPV的VP1基因大小约为2 256 bp， 当中也包含VP2基因的完整阅读框架。在CPV中VP1与VP2结构极为相似，区别在于VP1的N端较VP2多出特有的143个氨基酸残基序列，其中VP2基因全长1 755 bp，编码584 个氨基酸[14]。而作为自主性细小病毒特有的VP3仅在完整的病毒粒子衣壳蛋白中存在。在CPV、FPV研究中发现，Poly(A)序列下游具有TATA序列，TATA序列是RNA多聚酶起始转录识别部位，位于5′端帽子部位上游序列30—35 bp处。前人研究表明，细小病毒中VP2蛋白的表面具有“抗受体”，能够与细胞上的受体结合并启动内化过程[15]。由此证明，VP2蛋白在病毒增殖过程中，决定病毒的宿主范围，对结合及进入细胞等都起到重要作用。

2.3 猫细小病毒

FPV基因组长约5 200 bp。FPV同样具有回文结构，其中3′端的结构长度固定，但5′端的结构长短不一，可含有1～3个重复序列，这2个回文结构与FPV基因组的复制密切相关，能够使宿主细胞的RNA聚合酶Ⅱ分别启动结构蛋白(VP1和VP2)和非结构蛋白(NS1和NS2)转录。有学者发现，FPV或CPV的基因组具有互补性，即在病毒粒子中部分DNA分子有正极性，同时还有部分DNA分子有负极性。而在近期研究中表明，只有负极性的DNA链才可以被包装进入病毒粒子中。

2.4 鹅细小病毒

GPV基因组长度约为5 106 bp。其中包括2个开放阅读框，两者间隔18个碱基，同时两端含有末端倒置重复序列(ITR)：左侧的ORF编码非结构蛋白(NS1和NS2)，产生于病毒复制的早期，也称Rep蛋白；右侧的ORF编码结构蛋白(VP1、VP2、VP3)，编码核酸数分别为2 199 nt、1 764 nt和1 605 nt。VP1和VP3的起始密码子是较为常见的AUG，而VP2则是以不典型的ACG为起始密码子。目前发现的所有GPV毒株的VP2起始密码子均为ACG，具有高度的保守性。VP1对病毒感染有着重要作用，可帮助病毒或DNA顺利进入细胞核内部，或与宿主细胞的特殊受体结合，使病毒进行有效的感染。VP2是主要免疫功能区，具有免疫原性，可通过刺激机体使其产生抗体。有研究对GPV氨基酸序列进行配对分析，发现VP3中含有GPV主要抗原决定簇成分，由此推断，VP3是决定病毒毒力的基因[16]。

3 4种细小病毒致病机制

3.1 猪细小病毒

Oraveerakul等[17]为了解2株PPV毒株致病性不同的原因，利用原位杂交技术来检测两毒株在猪胎儿体内复制部位及数量上的差异，结果表明，对于不同毒株，其DNA的复制具有组织选择性，不同组织中病毒含量有所不同。Bergeron等[18]研究认为，PPV的非结构蛋白及结构蛋白决定着该病毒的宿主范围。李厚伟等[19]研究检测确定PPV感染定植部位为母猪的子宫，由此推断，PPV对宿主的致病部位主要是在繁殖器官，通过观察发现，就仔猪而言，病毒主要集中在其肾脏、脾脏和肠道淋巴结部位。姜永厚等[20]利用ELISA双抗体夹心法检测感染猪不同脏器中的病毒分布情况，检出结果分别为：肝脏中含量为22.7%，心脏中含量为36.4%，脾脏中含量为50%，肾脏中含量为66.7%。PPV在感染妊娠母猪后，可使其黄体发生萎缩，导致失去抑制排卵及分泌孕酮的能力。前人研究证明，PPV诱导宿主炎症反应[21]。当前PK-15细胞是一种已知的猪肾上皮细胞系，被证明是研究PPV激活的NF-κB信号通路的合适细胞系，当PPV感染PK-15后，NF-κB基因活性提高，Jak1基因表达量增加，据此推测PK-15细胞可通过激活NF-κB依赖性途径和JAK/STAT途径来抵抗PPV感染[22]。

3.2 犬细小病毒

Raj等[23]研究表明，CPV导致犬急性出血性肠胃炎，并且主要由于VP2基因的突变而易于遗传进化。CPV主要的自然感染方式为口腔感染，因此病毒的定植部位大多数为口腔咽鼻(包括扁桃腺及其他淋巴组织)。经过血液传播病毒对其他器官进行感染，一般情况下感染后的1～3 d可在扁桃体、咽淋巴结、胸腺、胸淋巴结中检测到CPV，在感染的3 d后，肠腔的相关淋巴结组织内均可检测到CPV。Hoelzer等[24]发现，CPV的复制发生在迅速分裂的小肠的绒毛上皮细胞中，CPV在宿主中主要攻击2种细胞，分别为肠上皮细胞和心肌细胞。感染肠腺胚上皮组织后，导致细胞无法正常代谢更新，从而引起上皮组织被破坏，肠绒毛变短，肠腺上皮细胞发生不同程度的坏死、脱落。当CPV感染心肌细胞时，病毒在心肌细胞内进行大量增殖，心肌毛细血管发生扩张及充血现象，同时淋巴和骨髓增殖细胞受到严重损伤，导致淋巴细胞减少。因此，当CPV感染严重时会伴随出现淋巴细胞减少症和中性粒细胞减少症。Nho等[25]利用原位杂交法对石蜡组织切片中的CPV进行检测，结果表明，在同一幼犬体内肝脏、肾脏及心脏组织中均存在CPV，说明CPV侵害器官组织种类范围逐渐扩大。

3.3 猫细小病毒

FPV通常最初是在宿主的口咽部定植复制，随后将会发生病毒血症2～7 d，在其过程中病毒分布在全身的各个组织中。由于细小病毒的特性，FPV主要侵害快速分化或分裂的组织，例如幼兽的肠上皮细胞及骨髓或是妊娠母兽的胎盘及胎儿等。FPV在感染6周龄以上猫中，淋巴组织、骨髓及肠黏膜最常受到影响。在感染淋巴组织时，FPV可使细胞衰竭从而引起免疫抑制。在病毒作用过程中淋巴细胞不仅出现直接溶解现象，同时淋巴细胞也会迁移到组织中。FPV会阻碍肠内隐窝中的细胞黏膜的快速复制但对不分开的吸收细胞尖端绒毛不产生影响。由于隐窝细胞受到破坏致使肠绒毛损伤，使患病动物吸收不良而产生腹泻。

3.4 鹅细小病毒

当前GPV的致病机制研究仍不十分清楚，且相关研究报道较少。关于宿主细胞的种类区别、细胞受体的类型划分及跨膜侵染机制等研究均未见报道，近年来GPV致病机制研究越来越受到人们的重视，特别是GPV在患病雏鹅体内的定植部位、病毒复制机制等。通过资料了解GPV在宿主体内各组织的分布情况，GPV最终定植部位可能为肠道上皮细胞。通过PCR方式检测病鹅体内病毒含量情况，发现在感染后24 h内即可在心脏、肝脏、肺部、肾脏、脾脏、十二指肠、空肠、胸腺等部位检测到GPV，在感染的第3天在盲肠内检测到GPV，在感染的第4天在粪便及大脑中检测GPV呈阳性，在感染的第5天在食道中检测到GPV。而在感染后的第6天开始发现，GPV在各组织中含量逐渐降低甚至消失，首先检测GPV呈阴性的部位为肝脏，后在盲肠及血液中陆续发现GPV检测为阴性的情况。感染GPV后，病毒侵染空肠盲肠使其发生急性亚急性卡他性-纤维素性坏死性炎症，逐渐出现固有膜结构发生紊乱，单核细胞和淋巴细胞发生弥漫性浸润，大多数肠腺结构被破坏，上皮细胞坏死脱落，脑膜充血，神经细胞变性等病变。根据多位学者的研究分析推测，GPV的Rep蛋白对于GPV的病毒增殖、病毒对宿主细胞的作用及其毒性影响都有着重要作用。对GPV结构基因序列比较，发现结构蛋白中有3个糖基化位点与番鸭细小病毒(MDPV)相同。在氨基酸序列方面，GPV与MDPV在440—530位的变化较大，在结构蛋白中的443—445位上GPV为NFN，在MDPV上则是NFS；在493—495位上GPV为NWN，相同位置MDPV为NWS。

4 小结及展望

目前，关于细小病毒致病机制研究虽然较多，但进展仍然较慢。细小病毒因其自身条件限制，主要选择侵害宿主体内分化较快、分裂迅速的组织，其中包括新生组织、胎儿及胎儿新生组织及成年动物的淋巴系统。在成年动物的淋巴系统中，肠上皮组织含有极多的分裂细胞源，由此成为细小病毒的主要感染目标。在细小病毒致病机制研究中，可考虑对宿主体内分化较快、分裂迅速的组织及细胞内病毒作用进行研究。在PPV致病机制试验中，可对PK-15细胞的作用多加研究。通过研究发现糖基化位点对病毒和宿主细胞的吸附产生影响，由此可推测，糖基化位点的差异与病毒感染宿主的特异性有密切关联。在研究细小病毒致病机制方面，应对以上内容加以深入探讨。目前，随着宠物数量的急剧增长，宠物疾病也逐渐得到重视，而作为患病数较多、危害较高的细小病毒流行也日益广泛，为找到高效安全的预防和治疗手段，细小病毒致病机制的研究体现了极大的重要性。