化学因子对蓝曼龙精子活力的影响

王 璞，王茂林，姜玉声，王 伟

(1.大连海洋大学农业部海洋水产增养殖学重点开放实验室，辽宁大连 116023；2.上海海洋大学，上海 201306)

蓝曼龙(Trichogastertrichopterus)属于鲈形目攀鲈亚目丝足鲈科，又称丝足鲈，是蓝星鱼的人工变种品种[1]。身体为椭圆形，侧扁；尾鳍呈叉状，腹鳍胸位，为长丝状。鱼体呈蓝灰色，体侧有两块不规则的深蓝色斑块，一般情况下，这两块斑块会连接形成一条深蓝色的斑块。腹鳍边缘具有微微的浅黄色；背鳍、腹鳍和尾鳍的浅蓝灰底色上分布着艳蓝色斑点。蓝曼龙在没有性成熟之前，雌鱼和雄鱼没有太大区别。成熟后，雌鱼腹部较饱满，背鳍圆而钝，体色较黯淡，丝状胸鳍基部红色不明显，雄鱼性状与之相反。亲鱼性成熟年龄为6个月，成熟的蓝曼龙游动起来非常缓慢，但这种鱼攻击性很强，喜欢攻击比它弱小的同种或异种鱼类。蓝曼龙鱼体鲜艳好看，幼鱼经常去水面吐泡泡，十分滑稽可爱，它对水质的适应能力较强，所以是被观赏鱼爱好者广泛养殖的品种[2]。

目前只有少数学者对蓝曼龙的生长、繁殖和生物学进行了研究。魏东等[1]和董艳珍等[3]研究了蓝曼龙鱼的人工养殖及繁殖；郑曙明等[4]研究了pH和硬度对曼龙鱼孵化率和稚鱼成活率的影响；陈友铃等[5]研究了蓝曼龙的染色体组型；胡传路等[6]对蓝曼龙配合饲料中最适蛋白含量进行了初步研究。该研究分析了不同浓度KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2溶液对蓝曼龙精子活力的影响，以期为蓝曼龙的人工繁殖提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料试验用鱼购自大连市香炉礁观赏鱼市场，挑选体色鲜艳、健康活泼、体型较大的雄鱼20尾，体长(15.0±0.5)cm。试验用鱼放于实验室中在水温27 ℃下进行暂养管理，为采集精液做准备。

1.2KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2溶液配制试验采用分析纯的 KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2试剂，再分别用纯水配制成10个浓度梯度：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 g/L，纯水作对照。

1.3精液采集及精子活力观察将捞出的雄鱼放置在冰袋上，等鱼体静止后，用纸巾擦干鱼体表的水分，解剖获取乳白色的5期性腺，再将收集到的性腺匀浆后放置在培养皿中保存。

打开显微镜，利用干燥的针头在载玻片上涂抹少量的蓝曼龙精液，放在40×10倍的光镜下，在载玻片的精液上滴1滴配制好的试剂，快速用针头搅拌均匀后观察精子活力。精子活力是指精子从开始运动起到视野内90%的精子停止颤动的时间[7]，用秒表计时。每个浓度试验重复3次以上。

1.4数据处理试验数据用SPSS 13.0统计软件分析，用Excel软件绘图。

2 结果与分析

2.1KCl、NaCl溶液对蓝曼龙精子活力的影响KCl处理下对照组精子活力为56 s，试验组精子活力为34～245 s。由图1可知，KCl浓度很小时(0.1、0.2 g/L)，其对蓝曼龙精子活力的影响并不大。当KCl浓度上升到0.3 g/L时，其对蓝曼龙精子活力有了提高的作用。KCl浓度从0.3～0.5 g/L时，精子活力快速增加，在浓度为0.5 g/L时达到最高，为245 s。当KCl浓度高于0.5 g/L时，精子活力逐渐下降。

图1 不同浓度KCl溶液对蓝曼龙精子活力的影响Fig.1 The effects of different concentrations of KCl solution on sperm motility of T. trichopterus

NaCl处理下，对照组精子活力为56 s，试验组精子活力为4～103 s。由图2可知，加入较低浓度的NaCl溶液对精子活力有明显的提升作用，激活率也逐渐升高，当加入的NaCl浓度为0.1～0.4 g/L时，精子活力不断升高。当NaCl浓度为0.4 g/L时，蓝曼龙精子活力达到最高，为103 s，此后再增加NaCl浓度，精子活力呈明显下降趋势。NaCl浓度高于0.8 g/L时，已经观察不到精子活动。

图2 不同浓度NaCl溶液对蓝曼龙精子活力的影响Fig.2 The effects of different concentrations of NaCl solution on sperm motility of T. trichopterus

2.2CaCl2、MgCl2溶液对蓝曼龙精子活力的影响CaCl2处理下，对照组精子活力为56 s，试验组精子活力为0～26 s。由图3可知，加入较低浓度的CaCl2溶液对精子活力具有显著的抑制作用。当CaCl2浓度为0.4 g/L时，蓝曼龙精子活力达最高值(26 s)。此后再增加CaCl2浓度，精子活力逐渐消失。当CaCl2浓度高于0.8 g/L时，已经观察不到精子运动。

图3 不同浓度CaCl2溶液对蓝曼龙精子活力的影响Fig.3 The effects of different concentrations of CaCl2 solution on sperm motility T. trichopterus

MgCl2处理下，对照组精子活力为56 s，试验组精子活力为2～20 s。由图4可知，加入较低浓度的MgCl2溶液对精子活力具有明显的抑制作用。当MgCl2浓度为0.3 g/L时，蓝曼龙精子活力达到最高值(20 s)。此后再增加MgCl2浓度，精子活力逐渐消失。当MgCl2浓度高于0.4 g/L时，已经观察不到快速运动的精子。

图4 不同浓度MgCl2溶液对蓝曼龙精子活力的影响Fig.4 The effects of different concentrations of MgCl2 solution on sperm motility T. trichopterus

3 讨论

3.1Na+、K+对精子活力的影响鱼类的精巢中，除了精液外，还存在许多其他物质。其中有一些抑制精子活动的因素，它们可以通过减缓运动强度来减少精子能量的消耗。一方面促进了精子的成熟，另一方面也保障了精子的储存。因此，到了繁殖季节，雄鱼可以持续不断地产出有活性的精子[8-9]。

试验结果显示Na+和K+在调控鱼类精子活力方面起到了重要作用。研究表明，Na+、K+对不同鱼类精子的调控结果不尽相同[10]。如柴毅等[10]研究表明Na+浓度为0.4%时，泥鳅的精子活力最强；而刘鉴毅等[11]研究表明Na+浓度为0.2%时，中华鲟的精子活力最强。该试验结果表明，NaCl浓度为0.4 g/L时，蓝曼龙的精子活力最强，激活率也最高。张涛等[12]研究证明了K+浓度为0.2%时，高体雅罗鱼精子活力最强；而刘鉴毅等[11]研究表明K+浓度为0.05%时，中华鲟的精子活力最强。该试验结果表明，KCl浓度为0.5 g/L时，蓝曼龙精子活力最强，激活率也最高。说明Na+、K+对不同种鱼类的最适调节浓度不同。

在鱼类的精浆中，存在着以Na+、K+为主的多种离子，导致精浆是一个高渗透压的环境，鱼类精子在这个环境中的活动受到了抑制[7]。但是当精液排出到水中，精液中的各种离子就会被水稀释，原本存在的抑制作用就会被减弱，精子被激活并开始运动。而一旦开始运动就会伴随着大量能量的消耗，此时精子活力就会逐渐减弱[13]。一定浓度的NaCl或者KCl对精子活力的减弱有限制作用，可以达到延长精子运动时间和激烈运动时间的作用[14]。因此，要注意Na+和K+浓度对精子活力的影响。当蓝曼龙精子活力达到最大后，再增加NaCl或是KCl浓度精子活力会逐渐降低。也就是说当外界激活液中离子的渗透压大于精液的渗透压，此时对精子的活动具有抑制作用。

3.2Ca2+、Mg2+对精子活力的影响在精浆的高渗透压环境中，除了存在Na+、K+外，同样存在Ca2+、Mg2+，但是试验结果显示，Ca2+、Mg2+对蓝曼龙精子活力的激活作用大体上与Na+、K+相反，对蓝曼龙精子的激活与活力存在明显的抑制作用[7]。即使是低浓度的Ca2+和Mg2+都会对精子活力产生十分明显的抑制作用，精子的快速运动时间和寿命同用纯水激活相比都是骤然下降，激活率同样如此。随着Ca2+、Mg2+浓度的继续升高，精子活力继续快速下降，抑制作用不断加大[15]。该试验中，当MgCl2浓度高于0.3 g/L时，显微镜下的视野中只有约1/5的精子在缓慢游动，并且很快就全部不动了；当CaCl2浓度高于0.4 g/L时，视野内几乎没有游动的精子，少数能动的精子也只是在原地颤动。这表明当CaCl2、MgCl2浓度过高时，其对蓝曼龙精子活力存在极强的抑制作用。究其原因，很可能还是与渗透压有关。CaCl2、MgCl2对蓝龙曼精子激活和精子活力存在明显的抑制作用。在配制激活液的时候，需尽量避免Ca2+、Mg2+浓度过高。

[1] 魏东，孙向军，梁拥军.蓝曼龙鱼的人工养殖及繁殖 [J].齐鲁渔业，2009，11(3)：65-67.

[2] 施振宁，陈亚琴.蓝曼龙的生活习性、繁殖及仔稚鱼的培育[J].水产科技情报，2002，29(3)：132-134.

[3] 董艳珍，吴健东.蓝曼龙鱼的人工繁殖试验[J].西昌学院学报(自然科学版)，2009，23(3)：44-45.

[4] 郑曙明，吴青，李玉宏，等.pH和硬度对曼龙鱼孵化率和稚鱼成活率的影响[J].水生态学杂志，1999(1)：4-5.

[5] 陈友铃，吴文珊，汪彦愔.蓝曼龙(Trichogastertrichopterus)的染色体组型、Ag-NORs及C-带型的研究[J].福建师范大学学报(自然科学版)，2005，21(2)：86-89.

[6] 胡传路，杨超，王基伟，等.蓝曼龙配合饲料中最适蛋白含量的初步研究[J].河北渔业，2013(8)：13-15.

[7] 严安生，彭安生，姚杏珍.不同浓度的电解质和非电解质溶液对花魤骨精子活动的影响[J].华中农业大学学报，1988，7(4)：375-378.

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[9] 邓岳松，林浩然.鱼类精子活力研究进展[J].生命科学研究，1999，3(4)：271-278.

[10] 柴毅，黄栋才，李罗新.几种化学因子对泥鳅精子活力的影响[J].安徽农业科学，2009，37(36)：17981-17982.

[11] 刘鉴毅，甘芳，危起伟，等.几种不同浓度的离子及单糖对中华鲟精子活力的影响[J].水生生物学报，2007，31(6)：849-854.

[12] 张涛，李胜忠，牛建功，等.Na+、K+、葡萄糖及甘油对高体雅罗鱼精子活力的影响[J].南方农业学报，2017，48(4)：734-738.

[13] 张树成，王弘毅，王介东.低温冷冻保存技术与精子库、卵细胞和胚胎库[J].生物学通报，2001，36(9)：4-5.

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[15] 苏德学，严安生，田永胜，等.钠、钾、钙和葡萄糖对白斑狗鱼精子活力的影响[J].动物学杂志，2004，39(1)：16-20.