螺旋藻制备高活性小肽的研究

余颉+赵述淼

摘要：以螺旋藻为原料，使用毕赤酵母发酵所产生的蛋白酶对其水解制备了高活性小肽。对酶解工艺条件进行研究，根据正交试验设计原理，在单因素试验的基础上，以DH和TCA-SNI为指标，对影响螺旋藻水解的各种影响因素：温度、pH、料水比、酶底比和时间进行了系统研究，得到了最佳工艺条件为：料水比1∶8、酶底比700 U/g、酶解温度55 ℃、pH值8.5，酶解时间3 h。在最佳条件下制备螺旋藻活性肽的水解度（DH）为11.82%，三氯乙酸-可溶性氮指数（TCA-SNI）为55.13%。利用凝胶过滤色谱法对酶解产物进行分子量的测定，结果显示：分子量小于1000 Da的寡肽占55.02%，小肽分子量分布主要集中在260 Da附近，约2个氨基酸残基，含量为29.07%。制备的螺旋藻肽粗蛋白含量为62.52%，总磷含量为1.00%，钙含量为0.13%，铁含量为803 mg/kg。

关键词：螺旋藻；酶解；活性肽

中图分类号：Q946

文献标识码：A 文章編号：1674-9944（2017）23-0023-04

1 引言￣

螺旋藻又称蓝细菌，是一种丝状多细胞螺旋体的原核藻类生物，属于蓝藻门颤藻科。螺旋藻具有很高的营养价值，其蛋白质含量高达60%～70%，是目前已知食物中最高的^[1]，而且含有丰富的氨基酸、维生素、脂肪、类胡萝卜素、多糖以及矿物质^[2]，是人类理想的食物及药物资源。螺旋藻是安全无毒的，早在400年前墨西哥等地已经开始食用螺旋藻^[3]，所以螺旋藻具有广阔的开发前景。

生物活性肽是由氨基酸组成的具有生物活性的肽类化合物。小分子的活性肽不仅能够提供机体生长发育所需的营养物质，而且具有增强免疫力、抑制细菌、抗氧化等功能^[4，5]。与游离氨基酸和蛋白质相比，肽能够更好、更快地被机体吸收^[6]。因此，越来越多的研究者开始关注生物活性肽，小肽的制备及其所具有的生物活性已经成为研究的热点，并且取得不少的成果^[7～9]。近年来，生物活性肽作为一种新型的饲料添加剂日益受到人们的关注，目前酶解螺旋藻制备活性肽的研究较少。笔者以螺旋藻为主要原料，对酶解螺旋藻蛋白制备高活性小肽的工艺进行研究，为蛋白小肽类饲料添加剂的产业化进程提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 实验材料和试剂

螺旋藻：北海生巴达生物科技有限公司；毕赤酵母蛋白酶：华中农业大学生科院发酵工程室；其余试剂均为分析纯。

2.2 主要实验仪器

PL303电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；FOSS DT208型消化炉：苏州安创仪器有限公司；Hlanon K9860凯氏定氮仪：济南海能仪器有限公司；FE20 pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；HH-6恒温水浴锅：常州澳华仪器有限公司生产；高速冷冻离心机：香港力康生物医疗科技控股有限公司；722S 可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司制造；Superdex Peptide 10/300 GL 层析柱：美国GE Healthcare公司；KQ3200E超声波清洗器：昆山市超声仪器有限责任公司。

2.3 实验方法

2.3.1 螺旋藻蛋白含量的测定

参照国家标准GB/T 6432-94《饲料中粗蛋白测定方法》^[10]进行测定。

2.3.2 毕赤酵母蛋白酶活力的测定

采用国家标准GB/T 23527-2009 《蛋白酶制剂》^[11]中的福林法进行测定。

2.3.3 螺旋藻酶解方法

称取一定量的螺旋藻，按照设计好的比例加入适量的水，用1 mol/L NaOH溶液调节体系的pH值，加入一定量的毕赤酵母蛋白酶在适宜的温度下进行酶解，反应结束后置于沸水中灭酶活10 min，迅速冷却，6000 r/min离心10 min，收集上清液测水解度（DH）和三氯乙酸—可溶性氮指数（TCA-SNI）。

2.3.4 水解度（DH）的测定

采用茚三酮比色法^[12]。

DH（%）=A1000×W×V1×100V2×100%

式中：A为查表得蛋白质的毫克数（mg）；W为称样重（g）；V1为水解夜的总体积（mL）；V2为显色时所用稀释液的体积（mL）。

2.3.5 三氯乙酸——可溶性氮指数（TCA-SNI）

TCA-SNI（%）=三氯乙酸中可溶性氮含量/原料中总氮含量×100%

2.3.6 凝胶过滤色谱法

将Superdex Peptide 10/300 GL层析柱用0.05 mol/L，pH 4.5的醋酸盐缓冲液平衡过夜。酶解液于10000 r/min离心10 min，取上清液过0.2 μm的微孔滤膜，然后取500 μL上样测定，洗脱液为0.05 mol/L的醋酸盐缓冲液，洗脱速度为0.5 mL/min。肽标准品为Angiotensin II Acetate（Mr 1046.2），Methionine Enkephalin Acetate（Mr573.7），Val-Tyr-Val（Mr379.5），Gly-Tyr（Mr238.2）^[13]。

2.3.7 营养成分的测定

参考国家标准GB/T 14924.9-2001《实验动物配合饲料常规营养成分的测定》^[14]进行测定。

3 结果与分析

3.1 螺旋藻酶解条件的研究

3.1.1 蛋白酶的筛选endprint

酶解法制备生物活性肽的关键是蛋白酶的选择，本实验选取了5种常见的商业化酶制劑和一种实验室自制的毕赤酵母蛋白酶，根据各自说明书上的最适温度和pH值进行酶解实验，DH和TCA-SNI的变化如图1所示。

由图1可见，酶解相同的时间，不同蛋白酶的水解效率是不同的，糜蛋白酶水解效果最好，胰蛋白酶和中性蛋白酶次之，毕赤酵母蛋白酶水解效果处于中等水平。糜蛋白酶酶切位点较少，如果选用它作用于蛋白，酶解片段一般较大，而且糜蛋白酶保存困难易分解。虽然中性蛋白酶和胰蛋白酶水解效果较好，但是成本较高，所以从经济成本和实验条件考虑，选用实验室自制的毕赤酵母蛋白酶作为最适蛋白酶进行酶解实验。

3.1.2 料水比对酶解反应的影响

料水比直接决定着底物浓度和反应体系，并且间接地影响酶浓度和酶与底物的结合机率。由图2可见，随着料水比的增加，螺旋藻蛋白的DH和TCA-SNI都迅速上升，但后期上升速度逐渐减缓，最高点在1∶12的水平。在工业生产中，料水比过高不仅蛋白浓度低不利于后期处理，而且极易染菌，增加生产成本；而料水比过低则溶液过度粘稠，会阻碍底物与酶的结合，不利于小肽的生成，所以综合考虑选用1∶10的料水比进行后续试验。

3.1.3 酶用量对酶解反应的影响

由图3可见，随着酶量的增加，螺旋藻蛋白的DH和TCA-SNI都迅速上升，并且上升幅度基本没有变化。这表明在底物浓度一定的情况下，酶没有达到饱和状态，所以加入的酶越多，样品水解的越彻底，产生的可溶性蛋白含量就越高。而在工业大批量生产中，所用酶量越高则会使生产成本大幅升高；而所用酶量太低则会使样品水解不彻底，不利于小片段肽的生成，所以综合考虑，选取600 U/g为最适加酶量。

3.1.4 温度对酶解反应的影响

由图4可见，在温度达到50 ℃之前，螺旋藻蛋白的DH和TCA-SNI随着温度的升高迅速上升，在50 ℃时DH和TCA-SNI到达最大值。当温度达到50 ℃以后，随着温度的升高，螺旋藻蛋白的DH和TCA-SNI都逐渐下降。这是因为在一定温度范围内，随着温度的升高，反应体系内分子运动更加剧烈，酶与底物结合机率增加，酶解反应速度加快，水解能力提高。但是当反应温度超过酶的最适温度以后，随着温度的升高，会破坏酶的三维结构从而使酶逐渐失活直至失去活性，因此50 ℃是毕赤酵母蛋白酶水解螺旋藻泥的最适温度。

3.1.5 pH值对酶解反应的影响

pH值是酶解反应的主要条件之一，pH值影响着酶的活性，过酸过碱都会使酶的空间构象发生改变，使酶活性降低，而且pH值影响着底物与酶的结合。由图5可见，随着酶解溶液pH的升高，螺旋藻蛋白的DH和TCA-SNI都逐渐上升，在pH值为8.0时DH和TCA-SNI达到最大值。pH值达到8.0以后，随着pH值的升高，水解度和可溶性氮指数都逐渐下降，此时pH值高于最适pH值，酶的空间结构被破坏，酶逐渐失活，所以pH值为8.0较合适。

3.1.6 正交试验结果

在单因素条件实验的基础上，以料水比、酶底比、温度、pH值为考察对象，以水解度DH为指标，进行正交实验以确定螺旋藻的最优水解条件，方案设计见表1，实验结果见表2。

由极差值分析得出，酶底比、料水比、pH值和温度4个因素对DH的影响主次顺序为：酶底比>料水比>pH值>温度。螺旋藻泥酶解的最佳组合是A2B3C2D2，即酶解的最佳组合是：料水比1∶8，酶底比700 U/g螺旋藻泥，温度55 ℃，pH值为8.5。由于该最优组合的条件并不在以上9组正交条件实验的条件中，所以在最佳实验条件下再次进行了验证实验，结果表明螺旋藻酶解后的DH值可达到11.82%，此时TCA-SNI为55.13%。

3.1.7 酶解时间的确定

采用最佳条件分别3 h、6 h和9 h进行酶解，然后产物进行凝胶过滤层析，图6为在最佳水解条件下酶解3 h、6 h和9 h产物的凝胶过滤图谱。从图中可以直观看出水解3，6，9 h产物的洗脱曲线并无明显差异。

将凝胶过滤层析图谱中峰位对应的洗脱体积代入线性回归方程y=-0.3882x+13.503，R2=0.9893，得到不同水解时间下多肽和氨基酸的峰面积比例，见表3。

由表3可见，随着时间的延长，分子量小于5000 Da、1000 Da、400 Da的多肽含量逐渐降低，而游离氨基酸含量逐渐增加，说明随着酶解的持续进行，部分小肽降解成游离氨基酸；另一方面伴随着酶解时间的增加，会导致生产周期大幅度加长，生产成本增高、能耗加高，而且水解时间过长会使螺旋藻酶解液染上杂菌，极难控制，不适宜在工厂中进行大批量生产，所以综合考虑酶解时间为3 h。

3.2 酶解产物分析

3.2.1 酶解产物分子量分布

将图6酶解3 h产物的凝胶过滤曲线上峰位对应的洗脱体积代入线性回归方程，得到酶解产物的分子量分布，见表4。因为酶解反应是连续进行的，所以多肽组分在5848～260 Da范围内呈连续分布，小肽分子量分布主要集中在260 Da附近，约2个氨基酸残基，含量为29.07%。

3.2.2 螺旋藻肽的常规营养成分

由表5可见酶解后的螺旋藻肽的营养成分基本符合饲料添加剂的标准，表明这种螺旋藻肽具有较高的商业价值和发展前景。

4 讨论

以螺旋藻为原料，通过正交试验确定了酶解法制备高活性小肽的最佳工艺条件：料水比1∶8、酶底比700 U/g、酶解温度55 ℃、pH值8.5，酶解时间3 h。在此条件下制备螺旋藻活性肽的水解度（DH）为11.82%，三氯乙酸-可溶性氮指数（TCA-S NI）为55.13%，小肽分子量分布主要集中在260 Da附近，约2个氨基酸残基，含量为29.07%。制备的螺旋藻肽粗蛋白含量为62.52%，总磷含量为1.00%，钙含量为0.13%，铁含量为803 mg/kg，基本符合饲料添加剂的标准，而且小分子的活性肽更容易被机体吸收，所以产品具有成为安全无公害的新型饲料添加剂的潜力。endprint

本课题还需要研究产物的生理活性，探索产物是否具有抗氧化性、抑菌性等生理功能，进一步挖掘產物的发展潜力，提高螺旋藻肽的商业价值，为螺旋藻肽成为新型饲料添加剂打下坚实的理论基础。

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Preparation of Highly Active Peptides From SpirulinaMud Protein Hydrolysate

Yu Jie1，Zhao Shumiao2

（1.HubeiEcologyPolytechnicCollege，Wuhan，Hubei，430200，China； 2.State Key Laboratory of Agricultural

Microbiology，College of Life Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan，

Hubei，430070，China）

Abstract： The preparation of highly active peptides from Spirulina mud by the enzyme which produced by pichiafermentation was studied.The orthogonal experiment was used to study the hydrolysis conditions.The influence factors，including temperature，pH，the ratio of material to water，enzyme dosage and hydrolysis time，were investigated according to DH and TCA-SNI.The optimum hydrolysis conditions were as follows： the ratio of material to water 1：8，enzyme dosage 700 U/g，hydrolysis temperature 55℃，pH 8.5，hydrolysis time 3 h.Under the optimal conditions，the DH of the hydrolysates reached 11.8% and the TCA-SNI of the hydrolysates reached 55.13%.The molecular weight of enzymolysis product was determined by Gel filtration chromatography.The result showed that the oligopeptide which the molecular weight was less than 1000 Da reached 55.02%.And the small peptide mainly with 260 Da molecular weight composed by 2 amino acids reached 29.07%.The hydrolysates had abundant nutrients： protein 62.52%，total phosphorus 1.00%，calcium 0.13% and iron 803 mg/kg.

Key words： Spirulina mud； enzymolysis； active peptidesendprint