延寄参胶囊中生物碱类化学成分的超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱法研究*

陈衍斌，何 娟，卢新义 ，马久太，孙宇宏,孙宝平,刘 峰1,△

1.陕西国际商贸学院 (咸阳 712000)，2.陕西步长制药有限公司(西安 710075)

延寄参胶囊是由延胡索、北刘寄奴、人参、骨碎补四味中药组成的复方制剂，现代药效学研究发现延寄参胶囊对犬冠脉血流量及冠脉阻力具有较大影响，相对于对照药地尔硫卓，延寄参胶囊能够有效地增加犬动脉流量，降低冠脉阻力；在对大鼠心肌缺血模型的研究中，延寄参胶囊能够降低缺血后再灌注引起的心律失常及心肌内丙二醛(MDA)含量，同时能够提升超氧化物歧化酶(SOD)活性；在对兔血小板聚集的影响研究中发现，与阿司匹林比较，该药物能够明显延长血栓形成时间[1]。延寄参胶囊可以从多方面对动脉粥样硬化所引起的病理损伤进行修复，缓解所引发的心脏不适症状，然而延寄参胶囊的化学成分及药效物质基础尚不明确，对其化学成分的研究工作十分重要。本文采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱法(UPLC-Q-TOF-MS)对延寄参胶囊中生物碱类化学成分进行分析。UPLC-Q-TOF-MS是一种将色谱的高效在线分离与质谱的高灵敏度、高分辨率完美结合的联用技术，能够准确快速地对中药复杂体系中的化学成分进行定性分析。目前，对延寄参胶囊中生物碱类化学成分的研究基本采用分离、提纯、鉴定的方法，很少采用LC/MS分析法。本研究首次采用UPLC-Q-TOF-MS法在正离子模式下对延寄参胶囊中的生物碱类化学成分进行了定性研究，旨在为延寄参胶囊中生物碱类化学成分快速准确的分析提供方法，并为其止痛药效的物质基础研究提供依据。

仪器与试药

1 仪 器 H-Class型超高效液相色谱仪、G2-XS QTOF型质谱仪、Masslynx 4.1工作站(美国Waters公司)；DV215CD型电子天平(德国梅特勒公司)；KUDOS型超声仪(上海科导超声仪器有限公司)；TDL-5A型低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；优普超纯水机(成都超纯科技有限公司)。

2 试 药 延寄参胶囊(批号1607121、1607122、1607131)；色谱纯甲酸(Sigma公司)；色谱甲醇、乙腈(美国Fisher公司)；水为脱气高纯水。

方 法

1 供试品溶液制备 称取延寄参胶囊内容物0.5g，于50ml的锥形瓶内，加入25ml色谱甲醇，超声30min后，将混悬液离心15min(5000r/min)，上清液用色谱甲醇稀释100倍后，用0.22μm的微孔滤膜过滤后备用。

2 色谱条件 色谱柱为ACQUITY UPLCTMBEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7μm)；流速为0.4 ml/min；柱温为35℃；进样体积为2μl；流动相为0.1%甲酸溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

3 质谱条件 质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；毛细管电压：1.0 kV；干燥气温度：350℃；干燥气流速：800L/h；雾化气压力：35psi；碎裂电压：135V；正离子模式下扫描检测，一级质谱扫描范围：100-1000 m/z，二级质谱扫描范围：50-1000 m/z；参比离子设置为m/z 556.2771。

4 数据分析 质谱数据采用MassLynx 4.1软件进行峰提取，UNIFI软件进行峰识别，结合Massbank数据库及相关文献报道进行确证。

结 果

本研究在正离子模式下共定性鉴别出9种生物碱类化合物，按照保留时间的先后顺序依次为四氢非洲防己碱、原阿片碱、延胡索乙素、小檗碱、海罂粟碱、黄连碱、延胡索甲素、非洲防己碱、氢化小檗碱。延寄参胶囊样品溶液在正离子模式下的总离子流图见图1，总离子流图中3-8min局部放大图见图2，各化合物的质谱数据详见表2。

图1 延寄参胶囊(批号1607121、1607122、1607131)醇提物总离子流图(正离子模式)

图2 延寄参胶囊(1607121)醇提物总离子流图3～8min(正离子模式)

表2 延寄参胶囊(1607121)醇提物在正离子模式下的UPLC-Q-TOF-MS分析结果

本次研究检出的生物碱类化合物按照结构可以分为季胺类生物碱、叔胺类生物碱、原阿片碱类、阿朴菲类。以上各类化合物的裂解过程解析如下：

1 季胺类生物碱 化合物9的保留时间为6.91min，分子离子峰m/z338.1378为 [M+H]+。在二级质谱中，特征碎片离子m/z323.0125为 [M+H-CH3]+，m/z322.0045为 [M+H -CH3-H]+，特征碎片离子m/z 294.0321为 [M+H -CH3-H-CO]+。结合文献[2]报道，推测该化合物为非洲防己碱。同理推测化合物4为小檗碱[3]。化合物6的保留时间为5.84min，分子离子峰m/z320.0912为 [M+H]+。在二级质谱中，特征碎片离子m/z292.0715为[M+H-CO]+，结合文献[4]报道，推测化合物6为黄连碱。这三个化合物都属于季胺类生物碱，结构中的吡啶环结构无法发生RDA 裂解，主要通过取代基的碎裂形成碎片离子。在正离子模式下均产生[M+H]+的分子离子峰，二级质谱中邻二甲氧基先失去1分子甲基后再失去1 个氢从而形成亚甲二氧基，亚甲二氧基会继续丢失1分子一氧化碳从而形成1 个稳定的三元氧环。黄连碱的结构中无甲氧基取代，所以其裂解途径为直接丢失C=O。

季胺类生物碱以小檗碱为例图示其裂解途径及二级质谱图，见图3。

图3 化合物4(小檗碱)的二级质谱图、分子结构及裂解途径

2 叔胺类生物碱 化合物3的保留时间是5.32min，分子离子峰m/z356.1851为 [M+H]+。在二级质谱中，特征碎片离子m/z341.1622为母离子失去一个取代基CH3而形成，即[M+H-CH3]+；m/z324.1532为母离子失去一个取代基CH3OH而形成，即[M+H-CH3OH]+；此外，母离子还会发生RDA裂解，产生m/z192.0902、165.0803的互补碎片离子，结构中的四氢异喹啉部分为含氮碎片离子，苯环部分为互补碎片离子，结合文献[5]报道，推测化合物3为延胡索乙素。同理可推测化合物1为四氢非洲防己碱[6]，化合物8为延胡索甲素[5]，化合物10为氢化小檗碱[7]。四氢非洲防己碱、延胡索乙素、延胡索甲素、氢化小檗碱均属于叔胺类生物碱，结构相似，在正离子模式下以[M+H]+分子离子峰形式存在，在二级质谱中会出现RDA裂解形成互补的碎片离子。

叔胺类生物碱以延胡索乙素为例图示其裂解途径及二级质谱图，见图4。

图4 化合物3(延胡索乙素)的二级质谱图、分子结构及裂解途径

3 原阿片碱类 化合物2的保留时间是5.14min，分子离子峰m/z354.1336为 [M+H]+。在二级质谱中出现的m/z206.0055和m/z149.0122两个碎片离子为母离子发生RDA裂解所产生，结合文献[8]报道，推测该化合物为原阿片碱。其裂解途径及二级质谱图见图5。

图5 化合物2(原阿片碱)的二级质谱图、分子结构及裂解途径

4 阿朴菲类 化合物5的保留时间是5.74min，分子离子峰m/z 356.1849为 [M+H]+。在二级质谱中出现的m/z 325.1418 碎片离子为分子离子丢失1分子甲氧基形成；碎片离子m/z 310.1178为分子离子丢失1分子甲氧基和1分子甲基所形成；碎片离子m/z 294.1231为分子离子丢失2分子甲基形成；碎片离子m/z 279.1002为分子离子失去2分子甲氧基和1分子甲基所形成。结合文献[9]报道，推测化合物5为海罂粟碱。其裂解途径及二级质谱图见图6。

图6 化合物5(海罂粟碱)的二级质谱图、分子结构及裂解途径

讨 论

延寄参胶囊是一个由延胡索、人参、骨碎补、北刘寄奴四味中药材组成的中药复方制剂，化学成分体系较为复杂[10]。君药延胡索入心肝脾经，具有活血行气止痛的功效，其所含的生物碱类化学成分具有较强的生物活性，是延寄参胶囊的主要药效成分。通过上述研究共定性鉴别出9种生物碱类化学成分，分别是四氢非洲防己碱、原阿片碱、延胡索乙素、小檗碱、海罂粟碱、黄连碱、延胡索甲素、非洲防己碱、氢化小檗碱。本文首次采用高灵敏度、高分辨率的超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS)在同一条件下快速分析了延寄参胶囊中的生物碱类化学成分，为延寄参胶囊中生物碱类化学成分的快速鉴定提供了方法，同时也为阐明延寄参胶囊止痛类功效的药效物质基础研究提供了可靠依据。

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