N-乙酰氨基半乳糖转移酶6对乳腺癌细胞MCF-7增殖和迁移的影响

周文媛，任军，纪元，陈晓明

（温州医科大学 检验医学院 生命科学学院，浙江 温州 325035）

乳腺癌是全球女性最常见的癌症。综合乳腺癌诊断和治疗的现状，乳腺癌早期诊断标志物以及药物靶点的发现意义重大[1-2]。GALNT6是N-乙酰氨基半乳糖转移酶（N-acetyl galactosyltransferase，GALNT）家族的重要成员[3]，有报道称它与乳腺癌、胃癌等的发生发展存在一定的相关性[4-6]。它在乳腺癌中呈高表达状态，但其作用机制有待进一步探讨。本研究通过构建GALNT6低表达的MCF-7细胞株，检测GALNT6对乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移等生物学功能的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与载体：乳腺癌细胞MCF-7购自上海中国科学院细胞库。GALNT6的RNA干扰载体pGPU6/GFP/Neo-GALNT6和对照载体pGPU6/GFP/Neo-shNC均由上海吉玛技术有限公司设计合成。

1.1.2 试剂：胎牛血清FBS为美国Hyclone公司产品，RPMI 1640培养基为美国Gibco公司产品，胰酶细胞消化液、青霉素-链霉素溶液（100×）、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG和β-Actin小鼠单克隆抗体均购于上海碧云天生物技术研究所，CCK8试剂购于日本同仁株式会社，细胞周期检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司，GALNT6兔多克隆抗体购于美国Abcam公司，PCNA兔单克隆抗体购于美国Cell Signaling Technology公司，Prime Script RT Reagent Kit购于大连宝生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：将细胞置于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液中，用25 mL透气细胞培养瓶放在CO2培养箱中培养（37 ℃、5% CO2、95%湿度）。实验共分3组：Mock组：未转染组，NC组：空载体对照组，sh-GALNT6组：GALNT6低表达组。

1.2.2 Real-time PCR：采用Trizol法提取细胞总RNA，ND2000测定RNA浓度，同时观察样品OD260/OD280比值，比值在2.0左右时表示所提取的RNA纯度较高，可用于下一步实验。反转录过程根据试剂盒说明配制反应体系（20 µL）：4 µL 5×Prime Script Buffer、1 µL Prime Script RT Enzyme Mix I、1 µL Oligo dTPrime、1 µL Random 6 mers（100 µL）、0.5 µL样品RNA、 （12.5）µL RNase free H2O，将配制好的体系放入PCR仪上50 ℃反转录反应15 min，85 ℃ 5 s终止反应。再按照反转录过程根据试剂盒说明配制反应体系（20 µL），GALNT6、GAPDH荧光定量PCR反应条件为：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。用2-△△Ct法计算GALNT6的cDNA水平，并以GAPDH为内参基因，得出目的基因的表达情况。

1.2.3 Western blot：根据BCA试剂盒说明测定提取的细胞总蛋白浓度，用5×loading Buffer调整蛋白浓度，放置加热器内95 ℃加热变性10 min。配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶和浓缩胶，上样后进行SDS-PAGE蛋白电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭、孵育一抗（4 ℃摇床过夜）、TBST清洗、孵育二抗、TBST清洗、ECL化学发光检测，最后利用Image Lab图像分析软件测定各样本灰度值，利用灰度值进行蛋白表达强度的比较。

1.2.4 CCK8实验：将对数期生长的细胞调整细胞浓度为8×105个/mL，接种于96孔板中，置于细胞培养箱中常规培养；于生长24 h、48 h、72 h、96 h后各孔加入10 µL的CCK8试剂，继续常规培养1～3 h后，在酶标仪上于450 nm处测定各孔吸光度。细胞的生长抑制率计算方法：抑制率%=（ODo-ODs）/ODo×100%（ODo：未转染组吸光度均值；ODs：质粒转染组吸光度均值）。

1.2.5 平板克隆实验：使用6孔板接种细胞，每孔铺300个细胞，放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养，直到孔中出现肉眼可见的细胞克隆团（约2周）。900 μL 4%多聚甲醛固定细胞30 min，结晶紫染料染色20 min，洗去染色液，拍照记录实验结果。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞周期实验：取对数生长期的各组细胞，调整细胞悬液浓度为1×106/mL，取1 mL细胞悬液于1.5 mL EP管中，用70%的冷乙醇固定（2 h至过夜），染色前用PBS洗去固定液，加100 μL RNaseA水浴30 min，加入400 μL PI染色混匀，4 ℃避光30 min，上机检测。

1.2.7 划痕愈合实验：取对数生长期的各组细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种于6孔板中，每孔2 mL培养液，待细胞生长融合约90%时，使细胞同步后，PBS洗涤细胞，用10 µL枪头沿直尺做划痕标记，PBS将划下来的细胞洗去，加入2%血清的细胞培养液，在显微镜下拍照，记为0 h。继续将细胞放在CO2培养箱中培养，分别在培养24 h、48 h、72 h、96 h后拍照；利用电子ruler测量细胞间距后，计算各组各时段的闭合率（%）=（Do-Ds）/Do×100%（Do：0 h细胞间距；Ds：其他时间段细胞间距）。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。计量资料以 ±s表示，2组比较方差齐性，采用t检验，若方差不齐，则采用非参数检验；多组比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GALNT6的表达 Real-time PCR结果显示，Mock组与NC组比，GALNT6 mRNA的表达量差异无统计学意义（P＞0.05），而sh-GALNT6组与NC组比，GALNT6 mRNA的表达量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1A。Western blot结果显示，Mock组与NC组相比，GALNT6蛋白的表达量差异无统计学意义（P＞0.05），而sh-GALNT6组与NC组相比，GALNT6蛋白的表达量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1B。

图1 稳定转染sh-GALNT6 MCF-7细胞模型的鉴定

2.2 沉默GALNT6抑制MCF-7细胞增殖 NC组细胞24 h、48 h、72 h的平均抑制率分别是0.72%、3.40%、1.48%，sh-GALNT6组细胞24 h、48 h、72 h的平均抑制率分别是8.40%、20.99%、17.79%，2组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。Mock组、NC组、sh-GALNT6组克隆团形成数分别为：97.00±8.89、94.33±2.96、29.33±4.81，与NC组相比，sh-GALNT6组细胞的体外增殖明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。采用流式细胞仪对细胞的周期分布进行检测。以S期和G2期细胞所占比例作为衡量细胞周期分布差异的指标，Mock组与NC组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），而sh-GALNT6组（0.724±0.007）与NC组（1.021±0.038）比，S期和G2期细胞所占比例降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

2.3 沉默GALNT6对MCF-7细胞体外迁移的影响Mock组在24 h、48 h、72 h和96 h的闭合率分别是27%±3%、41%±2%、50%±3%、63%±3%；NC组在24 h、48 h、72 h 和96 h的闭合率分别是29%±4%、41%±3%、60%±4%、60%±3%；sh-GALNT6组在24 h、48 h、72 h和96 h的闭合率分别是9%±3%、14%±3%、28%±3%、30%±3%。Mock组与NC组细胞的迁移能力随着时间的推移而增加，在72 h达到最大值，2组细胞各时间段迁移情况比较差异没有统计学意义（P＞0.05）；sh-GALNT6组细胞的迁移能力也随着时间的推移而增加，但与NC组相比，迁移能力明显降低（P＜0.05），见图4。

2.4 GALNT6对细胞增殖和迁移相关因子的影响Mock组与NC组相比，PCNA蛋白的表达量差异无统计学意义（P＞0.05），而sh-GALNT6组与NC组比，PCNA蛋白的表达量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5A。Mock组与NC组比，cyclinD1蛋白的表达量差异无统计学意义（P＞0.05），而sh-GALNT6组与NC组比，cyclinD1蛋白的表达量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5B。Mock组与NC组比，MUC1蛋白的表达量差异无统计学意义（P＞0.05），而sh-GALNT6组与NC组比，MUC1蛋白的表达量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5C。

图2 平板克隆实验检测各组细胞的增殖能力

图3 流式细胞仪检测各组细胞周期的分布

图4 划痕实验检测各组细胞的迁移能力

3 讨论

糖基化是一种重要的蛋白翻译后修饰，肿瘤细胞蛋白质糖基化的改变直接影响着肿瘤的生长、黏附、迁移和免疫监视，而异常糖基化的糖蛋白在肿瘤的恶化侵袭及迁移中起着重要作用[6]。GALNT是一类研究较多的催化蛋白质O-糖基化修饰的起始糖基转移酶，将N-乙酰氨基半乳糖结合到蛋白质肽链的Ser或Thr上，由于糖蛋白表面糖链的异常变化可以影响改变细胞的正常生物特性，与肿瘤的发生发展密切相关[7]，有研究[3]表明GALNT在乳腺癌中异常表达。GALNT6是GALNT家族的重要成员，研究发现，GALNT6在乳腺癌中处于高表达状态[4-5]，但是其对乳腺癌细胞增殖和迁移的研究较少。

细胞增殖在肿瘤的发生发展中起着关键作用，肿瘤细胞增殖速度快，侵袭邻近组织并发生迁移，是肿瘤迁移过程中至关重要的一步[8-9]。本研究利用低表达GALNT6的乳腺癌细胞模型研究GALNT6与乳腺癌细胞增殖和迁移的关系，进一步了解GALNT6在乳腺癌发生发展中的作用，结果表明GALNT6低表达抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖和迁移。PCNA是增殖细胞核抗原因子，参与调节DNA的复制，使DNA复制与细胞功能相协调，与细胞的增殖密切相关，是反映肿瘤细胞增殖状态的良好指标[10]。有研究表明，它在细胞周期的G1期晚期和S期表达量达到峰值，不仅在DNA的合成中起直接作用，在DNA损伤修复、细胞周期控制、基因转录等方面也起着协调作用。本研究结果显示GALNT6低表达抑制PCNA的蛋白水平。细胞周期素在调节细胞周期的过程中起着关键作用，主要有cyclinA、cyclinB、cyclinD1及cyclinE 4种，其中cyclinD1在G1期向S期的发展过程中起调节作用，是细胞周期的启动子，它促进细胞从静止期进入细胞分裂周期，从而使肿瘤细胞增殖加快，有研究表示乳腺癌组织中cyclinD1表达增加是预后差的一种标志[11]。本研究检测结果显示，cyclinD1蛋白水平的表达呈下降趋势，表明低表达GALNT6后，细胞周期受到阻滞，并通过调节cyclinD1抑制了乳腺癌细胞的增殖。

MUC1蛋白是一种高糖基化、高分子量蛋白，又称附膜蛋白，是跨膜分子，同时也是GALNT6糖基化底物之一，并且GALNT6可通过MUC1分子发挥对乳腺癌的影响，它在维持上皮完整性和肿瘤的发生与迁移等方面都起到重要的作用[12-13]。由于MUC1在肿瘤组织中异常表达，使其成为一种重要的肿瘤生物学标志物[14]。本研究检测发现GALNT6低表达会抑制MUC1的蛋白水平，表明GALNT6与乳腺癌细胞MCF-7的迁移息息相关。

综上所述，GALNT6在乳腺癌细胞MCF-7增殖和迁移的过程中有着重要的作用，这表示GALNT6将来可能会成为治疗乳腺癌的分子靶点。

图5 Western blot检测各组细胞目的蛋白的表达水平

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