人类间充质干细胞治疗阿尔茨海默病相关调控的研究进展

袁佳欣 管丽娜 王梅慧 孙忠文 任 超△ 王晓彤△

1)青岛大学附属烟台毓璜顶医院神经内科，山东 烟台 264000 2)青岛大学附属烟台毓璜顶医院神经监护室，山东 烟台 264000 3)烟台芝罘医院，山东 烟台 264000

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是发生于老年和老年前期、以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性变，临床表现为记忆障碍、失语、失用、失认、视空间能力损害、抽象思维和计算力损害、人格和行为改变等。AD是老年期最常见的痴呆类型，占老年期痴呆的60%～80%[1]。AD的发病率不断上升，65岁以上发病率为1%～5%，85岁以上发病率为20%～40%[2]。目前AD的发病机制尚不明确，但随着研究的深入，已取得极大的进展。AD的病因多样复杂[3]，如β-淀粉样蛋白(Aβ)级联反应、Tau蛋白过度磷酸化、突触受损、神经营养因子和神经递质耗竭、线粒体功能紊乱、氧化应激、胰岛素信号转导途径、血管因素、炎症机制、钙代谢平衡失调、轴突转运障碍、细胞周期重返障碍、脂代谢紊乱等。其中最受肯定的是β-淀粉样蛋白(Aβ)级联反应，Aβ是AD脑内大量老年斑(senile plaques，SP)的主要成分，通过影响β淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)的水解从而导致脑组织内Aβ的释放增多或清除减少，或Aβ自我积聚形成的各种寡聚体等产生神经毒性作用，且Aβ积聚还可诱导Tau蛋白的聚集[4]、突触减少、氧化应激，使某些线粒体酶尤其细胞色素C氧化酶活性下降进而促使细胞凋亡[5]。病理学上的典型表现为大脑皮质神经细胞内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT，由过度磷酸化的微管Tau蛋白于神经元内高度螺旋化形成)、细胞外大量老年斑(嗜银神经轴索突起包绕β-淀粉样蛋白而形成)形成、大脑皮质细胞减少以及累及皮质动脉和小动脉的血管淀粉样变性[6-7]。依据AD发病机制的多种学说也形成了多种治疗策略[1-2]，如胆碱酯酶抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂、抗精神病药物、抗β-淀粉样蛋白治疗(分泌酶抑制剂治疗、免疫治疗)、神经保护性治疗(抗氧化、抗自由基、Tau蛋白去磷酸化治疗及抗炎症治疗)、雌激素替代治疗、抗生素治疗、降胆固醇治疗、钙离子拮抗剂、抗高血压药物、改善脑代谢药物、改善脑循环药物、中药治疗及联合用药等，但这些仅能缓解部分症状，尚不能阻止疾病的进程。而AD的治疗及护理需相当大的人力及花费，寻找AD的有效治疗方法迫在眉睫。目前AD的治疗主要集中于药物治疗，近几年药物治疗的热点主要集中于抗Aβ治疗，而抗Aβ三期、四期临床试验大部分以失败告终。干细胞的出现为本病带来了新曙光，干细胞在基础实验和动物模型等方面已取得一定效果，但仍有许多问题需解决才能推广到临床，如人类间充质干细胞(human mesenchymal stem cells，HmeSCs)向神经细胞方向分化受多种因子调控，调控问题一直是干细胞移植治疗较为核心的问题之一。本文将就HmeSCs治疗AD的调控因素做一综述，以期为将来干细胞治疗AD提供参考。

1 HmeSCs成为治疗AD的重要干细胞来源

神经发生在成人脑中首先记录在海马的脑室下区[8]和海马的齿状回[9-11]。神经系统的新细胞神经发生的最高水平是在胎儿和幼儿阶段，但成年大脑还含有干细胞，即使在高龄时也保持发育可塑性。干细胞治疗AD是近年的研究热点，干细胞可以在特定条件下通过增殖及定向分化成不同的功能细胞。SHIHABUDDIN等[12]认为，在神经退行性疾病中干细胞最主要的来源包括多功能干细胞(来源于胚胎内细胞团)、胚胎生殖细胞(来源于胎儿的生殖腺脊)以及神经干细胞(来源于胚胎、新生儿或成人脑内)。越来越多的研究发现，异种移植后人类胚胎干细胞不仅能够保存多能性和迁移能力，而且能够提高老龄大鼠的认知能力，对于许多难治性疾病特别是细胞及组织缺失或损伤性疾病，干细胞研究已成为其希望[13]，但伦理问题和免疫排斥等限制其进一步的临床应用[14]。而HmeSCs多潜能性的发现和向神经细胞定向分化的成功[15]，且其具有来源丰富、采集方便、可自体回输及较少发生免疫排斥反应等优点[16]，为神经干细胞的来源增加了新途径。HmeSCs能够产生多种间充质细胞谱系，包括骨骼、软骨、脂肪、肌腱和其他结缔组织[17-19]，包括肌肉和肝细胞[20-25]。一些体内移植研究显示HmeSCs的神经和胶质分化[26-30]，表明大脑环境产生的因子不仅可以使干细胞分化成神经元，而且可使移植的外源性间充质干细胞在脑内发现类似甚至相同的改变，这些均支持HmeSCs 可能成为干细胞治疗AD的重要来源。

2 调控HmeSCs分化的相关研究

2.1 HmeSCs移植治疗AD前的原始分化调控HmeSCs要想实现对AD患者的神经细胞替代治疗，最关键是其定向分化问题需要真正解决。然而，目前仅有少数HmeSCs体外分化为神经元的报道，且表达既不一致也不持久[31-32]。 nanog是最近发现的一个基因，负责维持胚胎干细胞的多能性[33-34]，具有至少12个富含丝氨酸和苏氨酸残基的N末端区域[35-36]，结构上nanog含有在同源结构域部分内编码的3个螺旋，且其中央同源结构域序列又可以分成3个区域。N端区域富含丝氨酸和苏氨酸残基，表明其磷酸化调节的反式激活可能通过与SMAD4的相互作用实现[36]。研究表明，nanog在胚胎干细胞、肿瘤和一些成体组织中具有活性[33-34，36-37]，胚胎干细胞在维持自我更新时会使得nanog急剧降低[33]，这已通过基因转染技术证实[38]。自然情况下，nanog可防止干细胞分化且与Oct-4、Wnt[39]和BMP-4[40]同时起作用，通过STAT-3维持相关细胞的未分化状态[33-34]。已有研究[41]将nanog作为提高人间充质干细胞等成体干细胞定向分化的的重要调控因子之一。同时，因nanog的调控在细胞技术工程操作层面上是较为简单的，故其临床应用前景令人兴奋。

2.2 HmeSCs移植治疗AD在患者体内的调控HmeSCs移植进入AD患者体内后一定会受到内环境相关因子的影响，其中最重要的是APP。研究发现，APP对移植干细胞的作用具有双重性。APP在胞外结构域中经β-分泌酶的裂解，产生可溶性膜相关的羧基末端胞外域片段，且异源β-分泌酶催化该片段的膜内切割，产生Aβ和C-末端。APP基因的外显子16和17编码β淀粉样蛋白(Aβ)，Aβ的积聚在AD的发病过程中起重要作用；而APP外显子9和10编码的APP 9～10的多肽对神经细胞生长、分化有营养和促进作用[42]。以往研究已表明，APP可能参与神经突生长、细胞增殖[43-45]、神经元迁移[46]和神经元分化[47]。有研究[41]发现，APP信号通路是参与神经干细胞分化的调控系统之一，而APP的过度表达导致这些细胞的胶质分化而不是神经分化，说明AD中的APP代谢诱导干细胞的神经胶质分化并导致干细胞群的耗尽，即使将干细胞移植到AD患者的大脑中，这些细胞也可能分化成星形胶质细胞，而不是在病理状态下有效产生神经元。在无血清无介质条件下，干细胞以神经球的方式向上迁移并分化成神经元，表明干细胞能够产生体外分化所必需的内源性因子。在早期无血清分化阶段，许多干细胞表现出相同的萎缩形态，即细胞发生凋亡性细胞死亡。SUGAYA等[41]观察到分化的干细胞接触附近的凋亡细胞，表明干细胞最初在无血清分化条件下成为凋亡细胞，随后表达迁移和(或)分化因子影响邻近细胞的命运。凋亡细胞释放许多因子，有研究[41]指出，凋亡细胞和APP之间有重要相关性，损伤的神经元和凋亡的神经元显示出对APP的强免疫阳性信号。此外，该报道称，在视黄酸介导的神经元分化过程中，APP的表达也有所增加。在视黄酸介导的人神经母细胞瘤细胞分化过程中，β淀粉样前体蛋白(APLP-1和APLP-2)的mRNA表达也有上调。各种细胞培养系统神经元分化过程中APP表达水平的提高表明其在分化过程中的重要作用，即凋亡细胞中的APP表达升高，并影响相邻细胞分化。分泌型APP(secreted APP，sAPP)也可以使培养的神经元产生蛋白激酶C和突触发生[48]，除了显著增强增殖，sAPP还能通过Ras途径激活PC12细胞中的MAPK(ERK)。由于MAPK激活可以诱导增殖或分化，sAPP有可能在HNSCs中激活该途径，从而诱导细胞分化。在神经干细胞的诱导下重建神经元回路的一种可能情况：从受损细胞或垂死细胞释放的sAPP可能优先诱导干细胞向神经胶质细胞分化，而这些神经胶质细胞又可以促进其他神经干细胞向脑部病变区域迁移，随后向神经元分化，这可能成为骨髓间充质干细胞移植治疗AD时在患者体内进行调控的重要靶点。

3 问题与展望

骨髓间充质干细胞治疗AD有很好的前景，但也存在问题需要解决，正如诺贝尔奖获得者马丁·埃文斯所说，目前干细胞研究的重点就是把实验的成果应用于实际的临床治疗中，而干细胞分化调控就是其中较为重要的关键环节之一，移植前的体外调控和移植后的体内调控都很重要，更好地应用新发现的相关靶点对调控机制做进一步研究，同时避免“干细胞旅游”[49]等的出现，我们结合既往经验[15，50-64]，赞同负责任的业内人士和专家的观点，鼓励大力开展基础及应用基础研究，科研性质的临床应用研究在部分有条件的医院可规范化开展。在相关研究不确切的情况下，暂不主张在临床上大规模推广应用。通过以上努力，希望HmeSCs治疗AD的道路上越走越远。