数字PCR在食品快速检测中的应用进展

胡重怡，张 威，郭 平，吕小丽，王 栋

(江西省食品检验检测研究院，江西 南昌 330001)

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是分子生物学领域的一项关键技术，直接推动了生命科学领域的飞速发展。在20世纪90年代后期，美国ABI公司在第一代PCR的基础上推出了第二代PCR技术——实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)，使得高灵敏、高特异性和精确定量的体外定性/半定量基因分析技术成为现实，但是，由于qPCR扩增过程中不能保证在反应过程中扩增效率保持不变和实际样品与标准样品以及不同样品之间的扩增效率是相同的，由此导致其定量分析所依赖的基础——循环阈值(Ct)不是恒定不变的，结果只是相对定量，且依赖标准曲线。在20世纪末期，为了达到绝对定量的目的，美国科学家Vogelstein和Kinzler提出了第三代核酸检测定量分析技术——数字PCR(digital PCR，dPCR)[1]，近年来数字PCR迅速发展起来并成为一种常用的核酸检测定量分析技术。

与传统PCR技术相比，数字PCR不依赖于扩增曲线的循环阈值(Ct)进行定量，不受扩增效率的影响，也不需要采用内参基因和标准曲线，准确度高、重现性好，可以实现绝对定量分析，具有高灵敏度、高精确度、高耐受性和绝对定量的优点，目前该方法在转基因定量分析、物种鉴定、医学诊断、致病微生物定性和定量分析等领域有较为宽阔的应用前景。

目前，各国对食品安全均高度重视，加大了对食品的生产、加工、流通和销售等各个环节管理和监控的力度。传统检测技术费时费力，因此亟需开发出快速、方便、准确、灵敏的食品检测技术。数字PCR可以在2～3 h对食品样品中核酸进行精确定量，在食源性病原体鉴定和预警、食品原材料掺假等现场中均能够快速出具检测报告，现已开始广泛被应用于食品快速检测中。本文就数字PCR技术在食品快速检测中的应用进行了回顾。

1 数字PCR的原理

数字PCR的技术原理可以用“分而治之”一句话简短概括，具体做法是先将核酸模板进行大量稀释，使其分配到大量的独立的反应单元中，每个反应单元对应不同数量的DNA模板分子。然后，对每个独立的反应单元进行PCR扩增反应，扩增结束后对每个反应室的荧光信号进行统计学分析。最终，根据泊松分布和荧光信号阳性的反应单元占总反应单元的比例来计算目的核酸序列拷贝数，因此数字PCR可以不需要根据标准样品和标准曲线就能实现核酸的绝对定量分析[2]。

虽然数字PCR技术的原理并不复杂，早在1992年Sykes等[3]就描述过其原理，然而在样品分配的环节上却一直难以突破，分配的数量和均匀性上都很难达到要求，Vogelstein等[1]在早期发明数字PCR时用市售的384孔板进行，需要进行大量分装和使用大量的试剂，人力成本和高昂的费用使得研究人员望而却步。直到近十几年来，油包水乳化微滴、集成微流体通路、纳米技术的快速发展，数字PCR技术终于突破了技术瓶颈，2006年美国Fluidigm公司基于集成微流体通路的原理成功开发出第一台商业化的数字PCR系统，从此数字PCR走进了商业化应用阶段。

目前，商业化的数字PCR产品按照分配样品的方式可以分成两大类：微滴式数字PCR(dropplet dPCR，ddPCR)和芯片式数字PCR(chip dPCR，cdPCR)，微滴式数字PCR以Bio-Rad公司和Raindance Technologies公司系统为代表，其主要原理是把每个样本的反应液均匀分割成数万个乳液包裹的微液滴，在每个微滴内分别进行PCR扩增反应，最后通过类似于流式细胞技术的方法逐个对液滴的荧光信号进行检测，计算含目标荧光的液滴占所有液滴的比例来检测目的序列的含量。而芯片式数字PCR以Fluidigm和Life Technology公司系统为代表，在这一技术中，反应液通过微流控等技术被均匀导入芯片上的反应仓或通孔中进行PCR反应，然后通过类似于基因芯片的方法扫描每个反应仓或者通孔的荧光信号，进而计算目的序列的含量[4]。目前这2种方法均能达到对单个样品分配成2万个以上独立的PCR反应，均能满足对样品的精确定量。

2 食源性病原体的快速检测

食源性疾病对人体健康易造成重大危机，而常规的微生物检测需要对待检样品进行增菌、分离、生物学鉴定等多个步骤，具有耗时长、实验操作繁复、特异性差和检出限高等问题，并且对一些无法培养的致病病原体，传统微生物检测方法往往无能为力；数字PCR技术具有快速、灵敏、准确等特点，弥补了常规检测方法的缺陷[5]。在食品中毒突发事件中，快速检测并确定何种食源性病原体也是后续治疗的关键参考因素，数字PCR技术在对食源性病原体的鉴定中起到重要作用。

在全球食物中毒事件中，常见的食源性致病体主要分为细菌性肠道致病菌和食源性病毒。常见的细菌性肠道致病菌有致病性大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、肉毒梭状芽孢杆菌、布鲁氏菌、空肠弯曲菌、蜡样芽孢杆菌、霍乱弧菌等。通过食品传播的食源性病毒主要有诺如病毒、轮状病毒、甲肝病毒和戊肝病毒等，值得引起注意的是目前病毒性腹泻发病率呈明显上升趋势，仅次于细菌性腹泻，尤其是诺如病毒，经常造成群体病毒性胃肠炎公共事件。

目前，针对常见的食源性病原体，如沙门氏菌、埃希氏大肠杆菌O157∶H7、单核细胞增生李斯特氏菌、阪崎肠杆菌、诺如病毒等均已开发数字PCR的方法[6-10]，对荧光定量PCR和数字PCR方法进行对比，发现数字PCR具有更高的灵敏度和更少的预培养时间，对抑制剂的抗性强，结果快速、敏感、可靠，且能做到绝对定量[11]。在多重致病菌检测中，利用数字PCR、实时荧光定量PCR和传统的平板培养法对水样中沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和单核细胞增生李斯特氏菌进行了检测和比较，结果显示：平板培养法仅对沙门氏菌检出，实时荧光定量PCR也存在漏检的情况，数字PCR对3种细菌都能实现检出[6]。数字PCR的抗抑制能力使其可能成为高通量筛选微生物以评估食品质量和安全性的有用策略，目前也已开发了同时检测乳制品中8种致病病原体的数字PCR方法[12]。

3 转基因食品的快速检测

自从1996年转基因作物被批准商业应用以来，转基因作物的商品化种植得到迅速发展。目前随着全球转基因作物种植面积的不断扩大，转基因产品的种类与数量逐渐增加，为满足转基因作物及其加工食品的安全监管需求，亟需开发快速和准确的转基因检测技术。以往荧光定量PCR法在转基因检测中必须依据转基因标准物质的标准曲线对待检样品进行相对定量，无法对转基因成分进行绝对定量，还容易对低含量转基因成分出现漏检，此外易受样品中抑制剂的影响，造成检测结果不准确。而数字PCR技术对低丰度核酸样本检测重复性好，对抑制成分不敏感，该方法在高通量转基因成分检测中检测成本也相对更低，可作为转基因成分快速检测技术[13]。

目前，数字PCR被大量应用在商业化最普遍的转基因大豆和玉米中。Köppel等[14]对4个新的大豆性状位点转基因株系开发了多重检测数字PCR方法。Fu等[15]针对9个大豆转基因位点开发了免预处理的数字PCR方法，检测限为0.1%，低于欧盟的标记阈值水平。Demeke等[16]对2种转基因大豆加标样品进行数字PCR定量分析，数字PCR可以对0.001%加标DNA样品进行精确定量分析。Corbisier等[17]用数字PCR和荧光定量PCR对2种转基因玉米的绝对拷贝数的比例进行了对比，发现数字PCR具有更高的精确度，可用于检测转基因玉米的DNA拷贝数比率。Morisset等[18]利用数字PCR同时检测2种转基因玉米基因拷贝的绝对数量，双重数字PCR测定的灵敏度与单独数字PCR灵敏度相当。Dobnik等[19]对所有12个欧盟授权的转基因玉米品系开发了2个独立的多重数字PCR方法，可以一次检测12个转基因玉米基因拷贝数。目前，开发多重数字PCR方法进行快速检测是转基因食品检测的热点问题。

4 食品源成分的快速检测

由于市场需求激增和原料价格的上涨，部分企业为了减少生产成本，在食品生产和销售过程中，掺入成本低廉的非产品标志的原料，以次充好、掺杂等问题日益突出，在食品安全监管过程中，需要开发快速、准确的食品质量安全监测方法。数字PCR由于不依赖于标准曲线和参照样本，可直接测得样品中目标基因的绝对拷贝数，目前该技术在食品安全检测领域中的应用潜力越来越受到关注。在动物源食品的掺假中，主要存在将廉价肉(如鸭肉)冒充或掺假高价肉的问题，目前对鸡肉、牛肉、猪肉、羊肉等动物源食品中掺假鸭肉均已开发出数字PCR方法[20-21]。在植物源食品掺假中，目前数字PCR同样也能应用在高价植物源食品掺假低价原料的鉴定，如橄榄油纯度、香味水稻的检测[22-23]。此外，数字PCR技术在植物源食品分析中还能对植物油通过检测动物源成分来鉴定地沟油[24]。数字PCR可以灵敏地检测出食品源掺假种类，并可以根据原料重量、DNA量和基因拷贝数的线性关系确定掺假比例，这是其他检测方法所不具备的优势[22]。

5 结论与展望

数字PCR虽然是近10年刚发展起来的一种新技术，但其凭借较好的准确度、重现性、绝对定量等优势，已经在食品快速检测中得到广泛的应用。目前，数字PCR技术在食源性致病微生物、转基因成分和食物源性成分的快速定量检测中都得到了较广泛的应用，尤其因数字PCR抗抑制能力强，可以开发多重数字PCR，通过一次检测在2～3 h可以对不同靶标基因进行高通量筛查。但目前数字PCR仪器较昂贵，多重数字PCR要求开发出配套试剂，试剂价格也较高昂，相信随着数字PCR技术和生命科学产业的不断发展，该技术将普遍应用于食品快速检测筛查中。相信在不久的未来，数字PCR技术将大大提高食品快速检测效率，并为食品安全的风险预警提供一种简易、快捷的检测手段，进而保障消费者的健康。