发酵中草药在水产养殖中的应用

孟 彬，孙敬锋，吕爱军

( 天津农学院 水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384 )

中草药作为我国传统瑰宝，经过几千年的传承，其药用价值在每个社会时期都曾得到广泛认可[1-2]。古代没有化学药物和抗生素，中草药是唯一可选择的药物，对于当时的疾病防治起着至关重要的作用[3]。时过境迁，即使在医学水平相对发达的当代，某些疾病的治疗也会选择中草药作为辅助治疗药物，且有事半功倍的效果。

19世纪中叶，国外许多科学家开始对鱼类的寄生虫病进行相关的描述记载，并且逐渐开始研究鱼病的预防治疗方法[4]。直到20世纪，世界范围内才开始针对水产动物疾病进行相关系统研究，其中包括病原生物的鉴别、分类、致病性、防治等方面，并且在这个过程中逐渐积累了丰富的理论和实践经验。在我国，相关研究在20世纪50年代后逐步开展，并且在鱼类的细菌性疾病、真菌性疾病、寄生虫病、病毒性疾病等方面取得了一定的成果，在一定程度上解决了生产过程中鱼类疾病的问题[5]。随着近年来经济的飞速发展，我国已经从传统的粗放型养殖开始逐渐向集约化养殖模式过渡。但目前在水产养殖动物疾病防治过程中，对抗生素的依赖程度依然很大。抗生素的使用不但使病原微生物产生了耐药性，也会导致残留药物在动物体内和水体中蓄积，严重降低了水产品品质，污染了养殖环境。

2006年欧盟颁发了相关的禁令，禁止整个欧盟区在畜牧及水产品养殖过程中使用抗生素，同时加强了对进口水产品抗生素残留的筛查力度，并且还抵制其他国家添加抗生素的产品向欧盟输送。我国农业部也曾经颁发《水产养殖质量安全管理规定》[6]，其中要求进行无公害绿色养殖，并且鼓励开发新的抗菌药物对原有化学药物和抗生素进行替代。中草药在我国水产动物疾病防治过程中的研究有广泛的记载[7-11]。中草药大部分都来源于自然环境，具有药用价值高、功能显著、副作用小等优点[12-13]。但是，传统的物理化学方法提取中草药有效成分，往往会破坏其活性成分，造成有效成分的活性大大降低，限制了中草药产业的发展。随着现代生物技术的突飞猛进，结合生物技术，尤其是酶工程、发酵工程等，将有益微生物和传统中草药相结合，不仅可以发挥中草药的作用，还可以发挥微生物的作用，二者作用相辅相成，在疾病防治、环境保护、环境修复过程中均可以发挥一定的作用。

1 生物技术在发酵中草药中的应用

随着科学技术的蓬勃发展，传统中草药炮制工艺的弊端逐渐暴露出来，如中草药活性成分提取不彻底，导致药物起效时间较长，药用价值发挥不完全。某些中草药具有一定的毒性，严重限制了部分中草药的使用，或者使用后产生一些毒副作用。如用麻黄治疗呼吸道疾病时，麻黄中的麻黄碱会导致人体心脏机能亢进。雷公藤具有清热凉血、活血化瘀的功效，但是这种草本植物有毒性，长期均作为杀虫剂使用，无法将其药用价值完全利用[14]。这些因素至今是中草药发展过程中无法突破的瓶颈。

现代发酵方法可以分为液体深层发酵和固体发酵两种,液体深层发酵不仅可以分离到菌丝体，而且生产量大、周期短、设备占地少; 固体发酵所需要的设备简单，发酵条件易控制，培养物中所有的营养物质和保健成分都可以被利用[15]。20世纪80年代，庄毅[16]创立了中药的双向发酵法，将具有活性成分的中药作为药性基质，被药用真菌发酵得到的产物称为药用菌质，整个发酵过程中会产生一系列复杂的生理活动和生化反应，产生新的活性成分和新的功能。中药不仅能提供真菌所需营养大量产生菌体，同时又能因真菌的酶而改变中药的原有结构，转化为具有活性更强、毒性更低或生物利用度更高的新的化学成分，这就是新型的双向性固态发酵技术，无需将药用真菌与次级代谢产物分离，二者共同使用，协同发挥药效。发酵中草药的目的是为了使有效成分最大程度地被释放出来，并且增强其原有的性能，促进药物活性成分被更好吸收利用[17]。微生物的分解转化能力强大，并且其次级代谢产物也十分丰富[18-19]。利用微生物的生长代谢与其生命活动来转化中草药，与传统中草药炮制学的化学方法和物理方法相比有以下优点：提高某些难以被直接利用成分的利用率，改变药物活性，缩短药物产生作用的必要时间，提高药效，降低毒副作用，扩大药物的适应症等[20]。微生物发酵的条件通常都是十分温和的，因此可以在最大程度上避免中草药中的活性成分在发酵过程中被破坏，可以最大程度提取到活性高的有效成分，使得药物在最大程度上发挥其药用价值。

在我国，中草药的生物转化研究起始于20世纪80年代，并且随着科学技术的发展，相关的研究也在不断深入。我国学者利用发酵工程技术，提高了灵芝、冬虫夏草等药用植物中多糖的含量，最大程度上发挥了这些珍稀药用植物的价值[21]。通过发酵技术对中药中有效成分的提取工艺进行改进后，降低了提取难度。有研究报道，利用自制复合酶对三七总皂苷、三七茎叶总皂苷等系列中药有效成分进行酶法转化，结果表明，复合物酶能高效的将药材中部分皂苷成分转化为低极性皂苷[22]。此外，戴燊等[23]研究发现，中草药经过发酵后，粗蛋白、粗脂肪、粗纤维等营养成分含量都有了不同程度的提高。王身艳等[24]研究发现，双向发酵后，白芍药苷及芍药内酯苷含量显著下降，产生了新的物质。

2 发酵中草药的优势

2.1 减毒增效

中草药的种类分为植物型、动物型、真菌型等。近年来，水产养殖过程中主要以植物型中草药作为添加剂居多。中草药中含有丰富的蛋白质、脂质、糖类、维生素、氨基酸等营养物质。微生物在生长繁殖过程中主要消耗动植物的一些蛋白、糖类等物质。中草药经过生物转化后，使得原有的一些不易被吸收的大分子物质降解为小分子物质，极大程度提升了吸收利用率。这些小分子物质在机体内代谢速率快，使得药物的分解过程更为彻底，并且机体可以充分吸收这些物质，有利于增强药效，大大提升中草药的利用率。同时，发酵可以减少原料中草药的用量，有效地节约了成本[25]。陈永强等[26]的甘草微生物发酵试验结果显示，微生物发酵可有效破坏分解甘草细胞壁，促进甘草中有效成分释放，发酵次生产物甘草次酸，可被肠道直接吸收，迅速作用于靶部位，对急性抗炎镇痛效果显著。

另外，发酵技术可以利用微生物对某些药物中的有毒物质进行分解，有效扩大了这些药物的药用价值，丰富了疾病防治过程中可选择的药物种类。张普照等[27]在研究中发现，利用药用真菌发酵雷公藤后，明显降低了其自身的毒性，但对药物活性的影响很小。董玫等[28]将肝癌细胞H22移植到健康小鼠体内，分别喂食传统煎制的六味地黄液和发酵六味地黄液。结果喂食发酵六味地黄液的患癌小鼠体内肿瘤细胞的增殖和生长受到了明显的抑制，但喂食传统煎制六味地黄液对受试小鼠体内的肿瘤细胞并没有明显抑制作用。马钱子在治疗跌打损伤、骨痛、瘫痪时有一定的功效，但是这种药材毒性也较强，临床上的治疗剂量接近中毒剂量，安全范围较小[29]。潘扬等[30]利用“双向发酵”技术发酵马钱子，结果显示，马钱子中毒性最强的成分马钱子碱和士的宁的含量均有明显降低，但是发酵并没有影响马钱子原有的抗炎、镇痛功效，推测发酵技术在减小有毒中草药毒性的过程中不会改变原有的药用活性成分。

2.2 产生新的物质

中草药经过益生菌发酵后可以产生生物碱、有机酸等抑菌物质，这些物质进入机体肠道中可以有效抑制有害致病菌的繁殖生长。同时，中草药中所含有的黄酮、皂苷、核苷酸、叶酸、多糖等活性成分本身也是益生菌生长所需要的活性成分，二者相辅相成构成了一个有机整体[31]。而且，部分中草药在发酵过程中，微生物代谢所产生的酶类与特定的底物相结合可以产生新的活性物质，在原有药材的固有药物价值基础上附加了一些新的药用价值，有效扩大了药物的使用范围及途径。王玉红等[32]向灵芝发酵液中加入黄芪，发现发酵液中多糖成分发生了变化，提示可能有新物质产生。李国红等[33]用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)发酵三七根须，结果显示产生了5种新物质。张敏等[34]发酵大豆制作中药淡豆豉，结果显示，发酵后的淡豆豉中苷元成分增高，糖苷成分降低，表明发酵后的原料大豆的糖苷配基发生了解离，可以得到游离的苷元，并且产生了一种新的纤溶性较好的纤溶酶，提升了淡豆豉的药用价值。金玲等[35]对决明子进行发酵，观察发酵前后5种蒽醌类成分的变化，发酵后大黄酚和大黄素甲醚增加至发酵前的2.15倍和1.34倍，芦荟大黄素、大黄酸的含量也有一定程度的增加，多数游离型蒽醌含量呈上升趋势，推断发酵有利于增加决明子中蒽醌苷元的含量。张栋健等[36]对传统中药枳壳进行发酵，比较同一批次的枳壳以及其炮制产物的超高效液相色谱，发现发酵后的枳壳图谱中出现了两个新的色谱峰，提示有新物质产生。杜晨晖等[37]按照一定比例将葛根黄连汤制成培养基培养酵母菌，观察发现，葛根黄连汤中酵母菌可以正常生长并且培养基干质量有所下降，表明酵母菌发酵过程中很可能利用了葛根黄连汤中的蛋白质、纤维素、淀粉等营养物质。进一步研究发现，发酵后的葛根黄连汤中的总黄酮和总生物碱含量均有一定程度的增加，推测很可能是因为发酵过程中酵母菌所产生的的纤维素酶、果胶素酶、糖苷素酶等降低了细胞壁对药物有效成分溶出的阻碍，进而增加了葛根黄连汤的有效成分。中药发酵是一个复杂的过程，微生物经过发酵产生许多酶类，如单宁酶、果胶酶、淀粉酶等，在酶类物质作用下，某些药用成分发生分解转化，从而产生新的药用成分。另外，中药影响微生物的生长代谢，进而改变微生物的代谢途径，产生新的代谢产物，最终使中药各组分成分的含量发生变化[38]。

2.3 协同发挥作用

发酵中草药所选取的微生物大多是一些益生菌。益生菌可以促进中草药在肠道中的消化吸收率，中草药中的药用活性成分可以促进肠道益生菌的增殖[39]。一些中草药中有机酸含量很高，这些有机酸被人类或其他动物摄食后进入肠道，有利于保持肠道弱酸性的微环境。这种弱酸环境在抑制有害微生物繁殖的同时促进了有益微生物的繁殖，肠道菌群处于稳定状态，使得中草药中活性成分更容易被充分吸收。另外，微生物具有一种“破壁作用”，使得中草药中的营养成分更容易被充分利用，促进了中草药中有效成分在机体中的代谢和运输，在提高药效的同时减少了药物的使用量[40]。中草药往往都含有一类活性物质称为生物碱。生物碱是一种广泛存在于中草药中的含氮有机化合物，是中草药中的一类很重要的化学成分，对于疾病的防治起着重要的作用[41]。但是，生物碱类物质的存在导致传统煎制和提取出的中药液有很强烈的苦味，在一定程度上限制了中药液的利用。利用微生物发酵中草药，某些可以产酸的益生菌所产生的酸可以中和生物碱，降低了中药液中的苦味，改善了口感，增加了中草药的利用率。但是药效是否会发生改变，还需要根据不同类型的中药以及益生菌设计不同的药理模型，并且对成分提取后进行相关的研究来证明[42]。

3 发酵中草药在水产养殖中的应用效果

3.1 提高诱食率，促进生长

3.2 增强机体抗病力

中草药含有种类丰富的药用活性物质，如多糖、有机酸、生物碱、皂苷、挥发性油等，在这些物质的作用下，中草药即使单独作为水产动物免疫制剂使用也有很好的效果[48-50]。但是，中草药中有些大分子活性物质不易被机体吸收，通过微生物降解成小分子物质，有利于水产动物的吸收利用，可以最大程度提高利用率，并且可以去除一些大分子杂质，有效增强药效[51-52]。通过发酵技术加工处理后的中草药制剂可以保留原有的药物活性、增加其含量，增强中草药药理作用。具发酵作用的益生菌可以分泌抑菌物质，也可以通过争夺营养或附着位点来抑制病原微生物的生长。此外，这些益生菌具有甲基化、羟基化、氧化等强大的生物转化能力，中草药经过发酵后，其有效成分得到更加充分的分离、提取，增强了药物的活性。同时，在大量活性酶的协助下，有利于发酵中草药制剂被机体快速吸收，在疾病防治、免疫调节等方面充分发挥天然药物和益生菌独特的优势,这都是在益生菌协同下完成的[53]。赵倩等[54]用嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)对鲤鱼进行攻毒试验，观察一周后发现，死亡率为基础饲料组>中草药组>酵母菌发酵中草药组>枯草芽孢杆菌发酵中草药组，进一步研究发现，与喂食基础饲料的对照组相比，喂食发酵中草药制剂后，鱼体溶菌酶活力上升，谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐的含量均有所下降，说明添加发酵中草药制剂可以提高鲤鱼的免疫保护率和溶菌酶活力，进而达到提高鱼体免疫力的作用。Muona等[55]研究发现，血浆中溶菌酶活性变化在一定程度上与循环系统白细胞数目变化呈正相关。汤菊芬等[56]在研究吉富罗非鱼(OreochromisniloticusGIFT)免疫保护率时，设置了5个试验组。其中对照组仅添加了基础饲料，其余组在基础饲料基础上又添加了中草药、益生菌制剂、复合益生菌制剂、发酵中草药制剂。结果表明，中草药和益生菌在单独作用时，对罗非鱼的免疫保护率均有所提高。但是添加发酵中草药制剂试验组明显优于其余4组，结果表明，无论是中草药还是益生菌制剂对于提高罗非鱼抗病能力均有显著作用。发酵不仅将益生菌和中草药进行了有机结合，同时最大程度上发挥了它们在增强免疫力方面的积极作用。谢炎福[57]在研究鲫鱼出血病的过程中发现，对病鱼分别投喂发酵中草药制剂和单独的复方中草药制剂进行治疗，结果显示，添加发酵中草药制剂组中鲫鱼(Carassiusauratus)的成活率要优于单独添加复方中草药制剂的对照组，表明发酵中草药对于鲫鱼出血病的治疗有显著作用。进一步分析试验结果发现，达到相同治疗效果时，试验组中发酵中草药的添加量小于对照组中未发酵中草药的添加量，说明发酵技术可以提高药物利用率，节约成本。

3.3 净化水质，改善水产品品质

4 展 望

目前，发酵中草药制剂的研究尚处于起步阶段，对于发酵条件、菌种选择、培养基的选择都亟待进行相关研究。在开发发酵中草药制剂的过程中要充分考虑以下因素：首先，水产动物适应的盐度不同而分为淡水水产动物和海水水产动物，在开发过程中应当根据盐度的差异选择不同的益生菌和中草药复方制剂，最大程度发挥有益效果。其次，根据水产动物的种类及需求不同，选择不同配比的发酵中草药制剂。最后，提取发酵后的中草药活性物质后应做相应的分析。虽然目前没有发酵中草药会产生毒性物质的报道，但是应不断研究，对可能含有毒性或功能不确定的活性成分加以分析、论证，真正创造出新型安全、绿色的添加剂。

发酵中草药制剂为新型制剂，含有中草药、益生菌的特点，使用后无残留。不仅能改善药用活性，发挥功效，其中的益生菌在进入肠道后可以发挥自身特点促进制剂的吸收。应用这种制剂可以降低养殖过程中抗生素的使用，推进无公害养殖的发展。

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