电解损毁杏仁中央核对大鼠牙移动疼痛的影响研究

乔虎 黄倩倩 周洪

[摘要]目的：研究杏仁中央核（The central nucleus of amygdala，CeA）对大鼠牙移动疼痛的影响。方法：采用电解损毁方法对成年雄性大鼠分别行CeA单侧（15只）及双侧损毁（15只）记为模型组，对照组行假损毁手术（30只），术后恢复3d，建立实验性牙移动模型，记录牙移动痛觉行为学变化，实验结束后灌流动物，取脑组织，切片染色，对毁损部位进行定位。结果：与对照组大鼠相比，模型组大鼠痛觉行为学指标-面部修整行为（Face-grooming）明显降低，尤其在加力1d后减少最为显著，且双侧损毁CeA对大鼠痛觉行为学指标的影响，即降低程度大于单侧损毁CeA组。结论：CeA在大鼠牙移动疼痛的调控中扮演重要角色，损毁CeA可一定程度地改善牙移动疼痛症状。

[关键词]杏仁中央核；电解毁损；牙齿移动；正畸疼痛；大鼠

[中图分类号]R783.5 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）11-0147-03

Abstract： Objective To study the effect of the central nucleus of amygdala （CeA） lesions on tooth movement induced-pain in rats. Methods Adult male rats were subjected to unilateral or bilateral CeA electrolytic lesions in model group， while the control group underwent false lesion surgery. Three days after surgery， experimental tooth movement model was established to record the changes in behavior of tooth movement induced-pain. Results Compared with the rats in the control group， the rats in the model group showed a significant decrease in the index of pain behavior-face-grooming， especially in one day. Moreover， the effect of bilateral CeA lesions on the rats'pain behavior was significantly reduced， that is， the degree of reduction was greater than that of unilateral CeA lesion group. Conclusion CeA plays an important role in the regulation of tooth movement induced-pain in rats.

Key words： the central nucleus of amygdala； electrolytic lesions； tooth movement； orthodontic pain； rats

在正畸治疗过程中，90%～95%患者会经历因正畸治疗而引起牙移动疼痛症状[1]，此疼痛严重影响患者的矫治积极性，已成为矫治初期患者放弃治疗的主要原因之一[2-3]，部分患者甚至因疼痛引发精神症状（抑郁、焦虑等），而无法正常工作、学习和生活。故如何减轻牙移动疼痛，提高正畸治疗品质，成为当前优化正畸治疗亟待解决的问题。

以往研究多集中于探讨牙移动疼痛的外周机制，而对其更为复杂和重要的中枢机制研究甚少。近年相关研究表明，杏仁核（amygdala）作为机体的情绪整合中枢，与疼痛情緒的产生过程及其躯体反应（回避行为）均密切相关[4-5]，被认为是联系疼痛和情绪的关键核团，因此，越来越被学者所关注。其中，杏仁中央核（the central nucleus of amygdala，CeA）是杏仁核投射至脑干和下丘脑的主要传出核团，并接受CeA外部的纤维投射，整合多种感觉信号包括伤害性感觉信息。同时，CeA也通过与前脑和脑干的广泛双向纤维联系进行疼痛反应的调节。

最近，M.Brügger等学者利用功能性磁共振成像（fMRI）的方法发现，当电刺激被试者上颌尖牙时，被试者脑部杏仁核的信号增强并伴有机体疼痛不适感[6-7]。Ana Paula等[8]研究证明，实验性牙齿移动促进大鼠杏仁中央核及外侧下丘脑区的Fos蛋白表达增强，且与施力强度相关。目前关于杏仁中央核在正畸疼痛中作用的相关研究鲜有报道，因此为明确CeA在牙移动疼痛调控中的作用，本研究拟对CeA行小范围单侧及双侧电毁损，以探讨CeA的功能，为阐明CeA中枢调控牙移动疼痛的机制提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组：60只雄性SD大鼠（250±20g，西安交通大学SPF动物实验中心提供），随机分为CeA双侧损毁组（n=15）、CeA单侧损毁组（n=15）和相对应的假损毁对照组（其中每组n=15）。动物饲养于SPF实验室，固体粉末消毒饲料，饮消毒清水，室温20℃，定期消毒。

1.2 主要材料和试剂：不锈钢拉簧（直径0.25mm、外径2.0mm、长度10mm、弹性系数500N/m，宁波东钱湖康立弹簧五金厂）；正畸测力计（807-006型，3M）；正畸用结扎丝（直径0.25mm，杭州奥索公司）；慢速牙科电机，直径为0.5mm的金刚砂车针（Marathon-6型，韩国）；京津釉质黏结剂（天津合材厂）；10%水合氯醛；1ml及10ml一次性注射器，75%乙醇，0.9%生理盐水；眼科剪。

1.3 正畸牙移动模型的建立：模型的建立同1.1中的分组方法[9]。用0.25mm结扎丝将特制的不锈钢拉簧的一端结扎于上颌左侧第一磨牙颈部，另一端结扎于2个切牙上，并用黏结剂固定。以50g力拉伸弹簧，使磨牙受到近中方向的拉力，形成大鼠磨牙近中移动的实验动物模型。

1.4 双侧CeA电解损毁术：腹膜腔内注射水合氯醛溶液（10% W/V，300 mg/kg），麻醉大鼠后，将其固定于脑立体定位仪上（SN-2N，Narishige，Tokyo，Japan），使前、后囟门处于同一水平面，颅骨左右对称。酒精消毒，去除颅顶毛发及皮肤，暴露颅骨，根据大鼠脑图谱确定CeA的位置（前囟后2.5mm，中线旁开4.2mm，颅骨表面下7.5mm）。用微型电钻在CeA描点处开孔至暴露硬脑膜，去除碎骨片及硬脑膜，植入同心圆损毁电极（CEA 200，Microprobes， USA），电极正、负极分别与直流电损毁仪（53500，Ugo Basile，Italy）输出端对应相接。地线接头夹于大鼠后肢上。开始实施电损毁刺激，即直流电刺激，400?A，持续25s，对照组操作时断开刺激输出，其余操作步骤相同。大鼠CeA电损毁后恢复3～5d，进行后续实验。

1.5 尼氏染色：选取CeA脑区的冠状切片，水化后切片浸入0.1%焦油紫染液中染色，时间为30min，分色，通过镜下观察控制染色时间，以观察到清晰的尼氏小体为准。蒸馏水冲洗后分别在85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇中依次进行脱色，时间为1min，二甲苯透明2次，每次时间为5min。最后滴加适量中性树胶，覆盖盖玻片，进行封片。镜下观察各组CeA电损毁具体部位及范围。

1.6 面部修整行为（Face-grooming）活动：包括多种动作，比如洗脸、摇头、舔爪、按摩下巴和擦拭口等。其中，擦拭口动作是最为突出的行为反应，可作为一种重复性强且可靠的测量实验性牙齿移动所引发疼痛的手段。测试具体方法为：在背景噪音不高于45db的房间中，将小鼠放置在一个透明的塑料笼（30cm×30cm×30cm）内。每天上午9：00～12：00使用摄像机监测小鼠face-rubbing活动。在记录开始前小鼠提前15min适应房间环境，每次监测时间为10min，每只小鼠记录3次，中间间隔20min。记录后的数据采用盲法分析。

1.7 统计学分析：使用SPSS 13.0软件进行统计学分析，数据统一以均数±标准差来表示，统计方法选用双因素重复测量方差分析，对时间和处理的主效应及其交互效应进行分析，进一步多重比较采用LSD检验方法。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 组织学定位：双侧CeA损毁部位位于视束尖端的背外侧；杏仁基底外侧核的背内侧及杏仁基底内侧核和杏仁内侧核的背侧。85%以上的吻尾向CeA被电解损毁所破坏。测试的60只动物中，共38只大鼠损毁位置准确，其中双侧准确损毁组9只，单侧准确损毁组10只，双侧假损毁组位置准确9只，单侧假损毁组位置正确10只。其他动物损毁位置或电极放置位置在CeA之外，这些结果均不纳入统计分析。典型CeA双侧电解损毁示意图，见图1。

2.2 双侧CeA损毁对大鼠牙移动疼痛行为学的影响：各组大鼠牙齿加力后均出现face-grooming等典型的痛觉行为学改变，即实验组牙齿加力后4h、8h、1d、3d、5d、7d、14d，大鼠的面部修整行为时间显著增多（1d时为高峰，随后逐渐减少），14d后与对照组比较无显著差异。

与对照组相比，双侧损毁CeA组大鼠的牙移动痛觉行为学减弱[F（1，8）=5.63，P<0.05]，尤其在4h～5d时间段内最为明显，差异均有统计学意义（P<0.05， LSD检验）；而在7d和14d时间点上，与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05， LSD检验）。见图2。

2.3 单侧CeA损毁对大鼠牙移动疼痛行为学的影响：与对照组相比，单侧损毁CeA组大鼠的牙移动痛觉行为学也有明显的减弱[F（1，9）=6.71，P<0.05]，其变化规律与双侧损毁CeA组近似，尤其在8h～3d时间段内最为明显，差异均有统计学意义（P<0.05，LSD检验）；而在其余时间点上，与对照组相比，無明显统计学意义（P>0.05，LSD检验）。由此可见，与双侧损毁CeA组相比，单侧损毁CeA组大鼠的牙移动痛觉行为学的减弱程度要更弱，见图3。

3 讨论

疼痛是一种不愉快的感觉和情绪体验，伴随有强烈的负性情绪和对疼痛刺激的回避行为。目前认为正畸疼痛的产生是由矫治力刺激牙周、牙髓组织伤害感受器引起兴奋产生冲动，并伴随局部炎症介质释放[10-12]，冲动经过Aδ纤维和C纤维传递至三叉神经节，最后向中枢神经系统投射而被感知。

近年已有研究表明，杏仁核（amygdala）作为机体的情绪整合中枢，与疼痛情绪的产生过程及其躯体反应（回避行为）均密切相关[4-5]，被认为是联系疼痛和情绪的关键核团，越来越被学者所关注。杏仁核作为边缘前脑的重要结构，包含十多个大小不同的核团，功能复杂[13]。其中，杏仁中央核（The central nucleus of amygdala， CeA）是杏仁核投射至脑干和下丘脑的主要传出核团，并接受CeA外部的纤维投射，其大量的外部投射终止于囊区（capsular CeA，CeC）和外侧区（lateral CeA，CeL），两者之间也存在交互纤维联系。CeA主要接受脊髓（三叉神经）-臂旁核-杏仁中央核通路的投射，整合多种感觉信号包括伤害性感觉信息。同时，CeA也通过与前脑和脑干（包括额叶皮层、海马、前扣带回、外侧下丘脑、臂旁核，孤束核及参与内源性疼痛调节的脑干核团）的广泛双向纤维联系进行疼痛反应的调节。

杏仁核中有特异性和非特异性伤害感受神经元可以接受伤害性刺激的传入，并和其他形式的感觉刺激信息进行整合，在下意识水平中形成对伤害性刺激的情绪反应和逃避动机，并进而通过其与皮层的双向联系形成意识水平的情感，通过与下丘脑及脑干多个核团之间的投射，产生内脏的情绪反应，通过与扣带运动区的纤维联系将伤害性刺激的逃避动机转化为躯体行为。杏仁核与内源性痛觉调制通路中的很多部位有纤维联系，可以通过这些部位参与内源性镇痛及应激镇痛等。杏仁核与疼痛和镇痛均有紧密相关。

影像学、药理学及生理学等多种学科均证实杏仁核参与了疼痛的调控。Helmstette等发现杏仁核在应激镇痛时主要是通过激活脑干的下行抗伤害系统发挥作用的，损伤杏仁核可减弱应激的镇痛作用。利用功能磁共振成像（fMRI）的方法发现，当给予伴有能够引起强烈情绪反应的疼痛刺激时，杏仁核的信号增强。由于在fMRI实验中，杏仁核在疼痛时的激活为双侧性，因此Bingel等[14]认为杏仁核负责处理与疼痛情感成分有关的信息，但也有实验表明在给予伤害性热刺激时杏仁核信号降低[15]。

本研究发现，与假损毁对照组相比，双侧损毁CeA组大鼠的牙移动痛觉行为学减弱，尤其在4h～5d时间段内最为明显，而在7d和14d时间点上，与对照组无明显差异。单侧损毁CeA组大鼠的牙移动痛觉行为学也有明显的减弱，其变化规律与双侧损毁CeA组近似，但减弱程度比双侧损毁要更弱，差异均有统计学意义。而在其余时间点上，与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。以上结果表明损毁杏仁中央核可显著减弱大鼠牙移动疼痛的程度，主要原因可能为为杏仁中央核参与了牙移动疼痛的中枢调控，如痛觉的编码和调制过程，故将该核团损毁后可起到阻断痛觉传导的效果，因此大鼠的牙移动疼痛症状可获得改善。

综上所述，杏仁中央核在牙移动疼痛调控中扮演重要角色，起着正性调控作用，有助于更深入理解正畸疼痛反应的机制，并将为正畸疼痛的治疗提供新的方法。

[参考文献]

[1]Asiry MA，Albarakati SF，Almarwan MS，et al.Perception of pain and discomfort from elastomeric separators in Saudi adolescents[J].Saudi Med J，2014，35（35）：504-507.

[2]Hussain AS，Al MT，Elias WY.Methodologies in orthodontic pain management：a review[J].Open Dent J，2017，11：492-497.

[3]Larrea M，Salvador R，Cibrian R，et al.A new equation for predicting evolution of oral pain in orthodontic treatment：a longitudinal，prospective cohort study[J].J Oral Facial Pain Headache，2017，31（2）：172-179.

[4]Thompson JM，Neugebauer V.Amygdala plasticity and pain[J].Pain Res Manag，2017，2017（2）：1-12.

[5]Shinohara K，Watabe AM，Nagase M，et al.Essential role of endogenous calcitonin gene-related peptide in pain-associated plasticity in the central amygdala[J].Eur J Neurosci，2017，46（6）：2149-2160.

[6]Brügger M，Lutz K， Br?nnimann B，et al.Tracing toothache intensity in the brain[J].J Dent Res，2012，91（2）：156-160.

[7]Brugger M，Ettlin DA，Meier M，et al.Taking sides with pain- lateralization aspects related to cerebral processing of dental pain[J].Front Hum Neurosci，2011，5（1）：12.

[8]Novaes AP，da Rocha MJ，Leite-Panissi CR.Tooth movement activates the central amygdala and the lateral hypothalamus by the magnitude of the force applied[J].Angle Orthod，2010，80（1）：111-115.

[9]Qiao H，Gao Y，Zhang C，et al.Increased expression of TRPV1 in the trigeminal ganglion is involved in orofacial pain during experimental tooth movement in rats[J].Eur J Oral Sci，2015，123（1）：17-23.

[10]Yang Z，Wang Y，Luo W，et al.Trigeminal expression of N-methyl-D-aspartate receptor subunit 1 and behavior responses to experimental tooth movement in rats[J]. Angle Orthod，2009，79（5）：951-957.

[11]Yang Z，Cao Y，Wang Y，et al.Behavioural responses and expression of P2X receptor in trigeminal ganglion after experimental tooth movement in rats[J].Archives of Oral Biology，2009，54（1）：63-70.

[12]Pannese E.The structure of the perineuronal sheath of satellite glial cells （SGCs） in sensory ganglia[J].Neuron Glia Biol，2010，6（1）：3-10.

[13]Frühholz S，Schlegel K，Grandjean D.Amygdala structure and core dimensions of the affective personality[J].Brain Struct Funct，2017，222（9）：3915-3925.

[14]Bingel U，Quante M，Knab R，et al.Subcortical structures involved in pain processing：evidence from single-trial fMRI[J].Pain，2002，99（1-2）：313-321.

[15]Becerra LR，Breiter HC，Stojanovic M，et al.Human brain activation under controlled thermal stimulation and habituation to noxious heat：an fMRI study[J].Magn Reson Med，1999，41（5）：1044-1057.

[收稿日期]2018-07-15 [修回日期]2018-10-31

編辑/贾敏